Rôle des nanodomains de Rho GTP-ase dans la régulation de signalisation cellulaire des plantes | Role of Rho GTP-ase nanodomains in regulation of plant's cell signalization

إنجليزي. Continuous perception and rapid reaction to their environment are crucial features of the plants in the course of their growth and development. To maintain the water status and acclimate to environmental constraints plants have developed short-term (fast regulation of stomatal aperture and tissue hydraulics) and long-term (alteration of root system architecture and leaf abscission) responses. Despite their central role, the early cellular events that lead to these adaptive responses are largely unknown. Whereas the molecular bases of plant osmotic perception are not fully characterized, reactive oxygen species (ROS) constitute first cellular response and they are crucial secondary messengers during osmotic signaling. Thus, the main question of this Ph.D. thesis is to dissect the molecular transduction and, ultimately, the perception of the osmotic stimuli. The cell plasma membrane is the major coordinator of many environmental signaling complexes. In the context of hyperosmotic constraint, the cell responds by accumulation Reactive Oxygen Species (ROS), produced enzymatically by Respiratory Burst Oxidase Homolog (Rboh), and additional pathway involving apoplastic ascorbate and iron (Martiniere et al., 2019). By combining gene candidate approach and varieties of microscopy technics we demonstrated that Arabidopsis Rho GTPase, Rho of Plants (ROP6) is the upstream regulator hub of the two ROS producing agents and it’s necessary to some downstream plant responses to osmotic stress. Furthermore, we demonstrated the mechanism by which ROP6 can directly regulate ROS production. ROP6 can recruit its effectors, RbohD and RbohF, in “osmotic specific” nanodomains on the PM. Indeed, it is known that ROP6 participates also in auxin signaling in cells. But, whereas this stimulus induces ROP6 nanodomain formation, the Rbohs effector proteins are absent of these nanodomains. Consequently, auxin does not induce ROS accumulation in cells. This shows that nano-organization of a single ROP isoform in the membrane can encode for signal specificity. This work also demonstrated a crucial role of one of the activators of the ROPs in the GTP-ase cycle, guanine nucleotide exchange factor (GEF) GEF14. It appears that GEF14 could be the specific activator of ROP6 in osmotic stressed environment. Small GTPase are classically acting downstream of membrane receptors. In plants, Catharanthus roseus Receptor-like kinases (CrRLKs) are known to participate in the perception of cell wall environment that is strongly impacted during hyperosmotic stress. By using live imaging methods, we demonstrated that Feronia, a typical member of CrRLK, is necessary but not sufficient for osmotic signaling by acting indirectly on ROP6 signalization by regulating its diffusion. Further studies revealed that anionic lipid phosphatidylserine (PS), which has been described to fine-tune the spatiotemporal dynamics of small GTPases (Platre et al., 2019), can be regulated by Feronia. Our observation suggests that Feronia is able to acts quantitatively on ROP signaling both in roots and shoot through the regulation of PS amount and clustering at the PM, therefore serving as a rheostat for the small GTPase signaling.In summary, this work shed some light on part of the molecular machinery of the osmotic signaling cascade in plants, where the small GTPase and cell wall sensing machinery refine the regulation of protein localization and dynamics within the membrane.

فرنسي. La perception en continue de l’environnement est crucial pour la croissance et le développement des plantes. Dans le cas de la contrainte hydrique, les plantes ont développé des réponses à court terme (régulation rapide de l'ouverture stomatique et de l'hydraulique tissulaire) et à long terme (altération de l'architecture du système racinaire et abscission foliaire). Malgré leur rôle central, les événements cellulaires précoces qui conduisent à ces réponses adaptatives sont largement inconnus. Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) constituent une des premières réponses cellulaire et sont des messagers secondaires cruciaux lors de la signalisation osmotique. Ainsi, la principale question de cette thèse est de disséquer la transduction moléculaire en amont de la production de ROS et, in fine, la perception du stimulus osmotique.La membrane plasmique (MP) est le principal coordinateur de nombreux complexes de la signalisation environnementale. La cellule répond à la contrainte hyperosmotique par l’accumulation d'espèces réactives d'oxygène (ROS) produites par les enzymes de la famille des Rboh (Respiratory Burst Oxidase Homolog), et une voie additionnelle qui associe le fer apoplasique et sa réduction par l'ascorbate (Martiniere et al., 2019). En combinant des approches génétiques et des techniques de microscopie, nous avons démontré que la Rho GTPase ROP6 (Rho of Plants 6) d'Arabidopsis est nécessaire et suffisant pour la production de ROS dans des cellules en réponses osmotiques. De plus, nous avons montré que ROP6 contrôlé un certains nombre de réponses cellulaires et tissulaires en aval de la production de ROS. Nous avons ensuite démontré le mécanisme par lequel ROP6 peut réguler directement la production de ROS. ROP6 recrute ses effecteurs, RbohD et RbohF, dans des nanodomaines spécialisés de la MP. En effet, on sait que ROP6 participe également à la signalisation de l'auxine. Mais, alors que ce stimulus induit la formation de nanodomaines ROP6, les protéines effectrices Rboh sont absentes de ces nanodomaines. Par conséquent, l'auxine n'induit pas d'accumulation de ROS dans les cellules. Cela montre que la nano-organisation dans la membrane d'une même isoforme de ROP peut coder pour la spécificité du signal. Ce travail a également démontré le rôle crucial de l'un des activateurs des ROP dans le cycle GTP-ase, le facteur d'échange de nucléotides guanine (GEF), la GEF14. Il semble que GEF14 pourrait être l'activateur spécifique de ROP6 dans un environnement soumis à un stress osmotique. Les petites Rho des plantes agissent classiquement en aval des récepteurs membranaires. Chez les plantes, on sait que les récepteurs kinases de la famille Catharanthus roseus (CrRLK) participent à la perception de l'environnement de la paroi cellulaire qui est fortement impacté lors d'un stress hyperosmotique. En utilisant des méthodes d'imagerie à super-résolution, nous avons démontré que Feronia, un membre typique de CrRLK, est nécessaire mais pas suffisant pour la signalisation osmotique en régulant indirectement la diffusion de ROP6. D'autres études ont révélé que la phosphatidylsérine (PS), un lipidique anionique connu pour affiner la dynamique spatio-temporelle des ROPs (Platre et al., 2019), peut être régulée par Feronia. Nos observations suggèrent que Feronia est capable d'agir quantitativement sur la signalisation ROP grâce à la régulation de la quantité de PS à la membrane et son regroupement en nanodomaines. Elle agit donc comme un rhéostat sur la signalisation ROPs. Ce travail a révélé l’importance de la dynamique des protéines au sein de la MP pour le fonctionnement de la signalisation Rho GTPase des plantes que ce soit à la fois pour déterminer la spécificité du signal mais également pour l’intégration des signaux.