Amélioration des teneurs et rendements en dérivés coumariniques et en coumarine libre du mélilot (Melilotus officinalis L. ; Fabaceae)

Ce travail s'inscrit dans le cadre d'un programme de recherche sur l'amélioration de la qualité de plantes médicinales. Une démarche générale a été élaborée visant à augmenter la teneur et/ou le rendement en principes actifs et fait intervenir plusieurs voies de recherche : génétique, agronomique et technologique. Le mélilot (Melilotus officinalis L.) est une Légumineuse fourragère, utilisée comme matière première par l'industrie pharmaceutique. Ses extraits entrent dans la composition de médicaments à visée veinotonique. L'ensemble des études pharmacologiques publiées dans la littérature concerne la coumarine libre, qui possède des propriétés antiphlogistiques, antioedémateuses et qui est utilisée comme protecteur vasculaire. La coumarine libre n'existe pas dans le mélilot frais. Elle se trouve sous forme de glucosides d'acide ortho-hydroxy-cinnamique (GOHCA) trans et cis et localisés dans les vacuoles de la plante, principalement au niveau des feuilles. Le GOHCA trans est isomérisé en GOHCA cis sous l'action des U.V., puis hydrolysé en coumarine libre par une ß-glucosidase inter-cellulaire spécifique, lors de la rupture des tissus de la plante. Nous entendons par dérivés coumariniques la somme des deux glucosides précédemment cités exprimée en coumarine. L'objectif appliqué de ce travail est de produire du mélilot à forte teneur en dérivés coumariniques, et de transformer au mieux ces glucosides en coumarine libre au cours de la récolte et des étapes de transformation ultérieures afin de produire du matériel végétal à 0,7% de coumarine libre. En effet, la teneur moyenne en coumarine libre du mélilot utilisé par l'industrie pharmaceutique n'est que de 0,3%. L'objectif scientifique est de déterminer les facteurs susceptibles d'intervenir à la fois sur la synthèse des dérivés coumariniques du mélilot et sur leur transformation en coumarine libre. La première partie de ce travail a permis de comprendre et de maîtriser les mécanismes de formation de la coumarine libre durant les étapes de transformation postrécolte (séchage, extraction). Une technique d'extraction et une méthode de dosage en chromatographie en phase liquide ont été adaptées. Une étude de la variabilité génétique inter et intra origines concernant les caractères teneurs et rendements en dérivés coumariniques a permis la sélection de populations et de génotypes performants. Après avoir mis au point une technique de micropropagation, nous avons pu travailler avec des clones. La seconde partie de ce travail a permis d'avancer dans la compréhension des mécanismes de formation, de migration et de stockage des dérivés coumariniques dans la plante. Nous avons pu montrer que les teneurs les plus fortes en dérivés coumariniques apparaissent dans les organes jeunes et physiologiquement actifs, comme les bougeons et les feuilles. Ceux-ci peuvent en contenir jusqu'à 3%. Le limbe, tissu possédant une forte activité photosynthétique, présente la plus importante teneur en dérivés coumariniques de la plante à l'état végétatif. Nous avons également mis en évidence que : pour un génotype donné, la teneur en dérivés coumariniques est liée à l'âge de la plante mais est indépendante de son poids ; les organes des niveaux inférieurs de la plante possèdent toujours une teneur en dérivés coumariniques plus faible que ceux des niveaux supérieurs ; la teneur en dérivés coumariniques est indépendante de la teneur en azote ; la densité des plantes en culture n'intervient pas sur la teneur en dérivés coumariniques alors qu'elle détermine de façon importante le rendement en matière sèche donc le rendement en dérivés coumariniques ; les dérivés coumariniques migrent des feuilles vers les racines en première année de culture ; la synthèse de dérivés coumariniques est dépendante à la fois de la quantité et de la qualité de la lumière. La troisième partie de ce travail concerne la mise au point d'un "itinéraire technique" visant à atteindre l'objectif de 0,7% de coumarine libre dans le matériel végétal sec. Aussi, nous sommes nous attachés à produire des organes jeunes en procédant à des récoltes précoces et multiples, effectuées sur une même parcelle. Du mélilot à forte teneur en dérivés coumariniques (plus de 1%) a été obtenu grâce à l'amélioration de la qualité du matériel végétal produit par le biais des techniques culturales. Le GOHCA cis a pu être totalement transformé en coumarine libre grâce à l'optimisation des techniques de récolte et de transformation du mélilot frais (conditions de séchage et d'extraction). La production de mélilot à plus de 0,7% de coumarine libre est maîtrisée. Les résultats obtenus, sur le mélilot, permettent ainsi de valider une démarche de recherche qui pourra être appliquée à l'amélioration des teneurs et rendements en principes actifs d'autres plantes d'intérêt pharmaceutique.

This work is included in a research programme concerning the quality improvement of medicinal plants. A general approach was elaborated with the aim of increasing the active substance content and / or yield and implies different approaches: genetical, agronomical and technological. Sweetclover (Melilotus officinalis L.) is a Leguminous officinal fodder plant used by the pharmaceutical industry. Its extract is a component of several antiphlebitic remedies. The published pharmacological studies concern free coumarin. This molecule has anti-oedematous properties and is used for chronic venous insufficiency. Free coumarin is not present in fresh Melilot but exists as a glucoside of the hydroxyl-cinnamic acid (GOHCA), trans and cis, in vacuoles, in particular in leaves. The GOHCA trans is isomerised under UV light into GOHCA cis and could be hydrolysed into free coumarin by a specific and inter-cellular ß-glucosidase. This reaction occurs during disruption of the tissue. We call “coumarin derivatives” the sum of the two glucosides, expressed as free coumarin. The practical goal of this study is to produce Melilot with a high coumarin derivative content and optimize the transformation of these glucosides into free coumarin during harvest and post-transformation stages to produce dry matter with 0.7% free coumarin. The average content in free coumarin in the drug used by the pharmaceutical industry arises only 0.3%. The scientific goal is to determine the factors involved in the regulation of the synthesis of sweetclover coumarin derivative and in their transformation into free coumarin. The first step of this work was to try to understand and control the mechanisms involved in the formation of free coumarin during the post-harvest transformation (drying, extraction) and to adapt techniques to optimize these reactions. Extraction and assay methods by liquid chromatography were performed. A study of the inter- and intra-origin variability for the characters “coumarin derivative content” and “coumarin derivative yield” allows the selection of interesting populations and genotypes. A technique of micropropagation was studied and applied to work with clones. The second part of this work consisted in the explanation of the mechanism involved in the synthesis and the storage of coumarin derivative in the plant. In the literature only older, often in contradictions works are available. In our experiment, we showed that the higher coumarin derivative contents appeared in the young and physiologically active organs, such as buds and leaves. They may contain up to 3% of these molecules. The lamina with their high photosynthetic activity showed the highest level of coumarin derivative in the vegetative plant. Experimentation during two years, on harvested clones, showed that: for a given genotype, the coumarin derivative level is determined by the age of the plant and is independent from its weight ; the organs of the lower parts of the plant always contain less coumarin derivatives than the upper parts ; the coumarin derivative level is independent from nitrogen content ; the plant density in the field has no effect on the coumarin derivative level but interferes with the dry matter yield and therefore on the coumarin derivative yield ; the translocation of the coumarin derivatives from the root to the leaves takes place at the end of the first year of cultivation ; the coumarin derivative synthesis is linked both to the light intensity and composition. The third part of this work concerns the determination of a crop management that would produce 0.7% free coumarin in the dry matter. So, we emphasized the production of young organs by having early and multiple cuts. Some sweetclover with high coumarin derivative content (above 1%) were obtained by the improvement of the quality of the plant material through agricultural techniques. The GOHCA cis could be totally transformed into free coumarin by the optimization of harvesting techniques and the transformation of fresh material (drying and extraction conditions). It was possible to control the production of Melilot with more than 0.7% of free coumarin. The results obtained here validate the present research approach, which could be applied to the improvement of content, and yield of other plants of pharmaceutical interest.