Effects of culture conditions on the photoautotrophic growth and biochemical composition of Chlamydomonas reinhardtii, as a potential source for hydrogen production

Hydrogen is a particularly attractive energy carrier, since its combustion produces water vapor only. The green microalga Chlamydomonas reinhardtii is able to produce hydrogen under sulfur-deficient anaerobic conditions and is used as a model organism for studying hydrogen metabolism in microalgae. Cultures with high biomass are required for an effective hydrogen production. Their biochemical composition, in particular, the contents of starch, protein, and chlorophyll are key factors affecting hydrogen production yield. The aim of this thesis was to investigate the effects of culture conditions on the growth and biochemical composition of C. reinhardtii by use of photoautotrophic batch cultures. The studied variables included nutrient concentrations in the growth medium, concentration of CO2 added to the cultures, light intensity, and temperature. We used factorial statistical designs to evaluate the individual and the interaction effects of these variables. Three series of experiments were designed and response parameters, such as the pH of the cultures, their productivity and biomass yield, and their contents of starch, protein, and chlorophyll were measured. In the first series of experiments, a 24 full factorial design was first used to quantify the effects of ammonium (7.5 and 17.5 mM), phosphate (10.0 and 20.0 mM), sulfate (0.2 and 0.9 mM), and carbon dioxide (2.0 and 5.0% v/v) concentrations on the studied response parameters. Then, the number of treatments was extended to twenty-five (with 5.0 – 20.0 mM ammonium, 7.5 – 22.5 mM phosphate, 0.1 – 1.0 mM sulfate, and 1.0 – 6.0% carbon dioxide) in a central composite design and the responses were modeled using a second order equation. The obtained second-order surface responses were used for an optimization procedure that predicted maximum responses and the corresponding values of the studied variables, which were assessed by model validation experiments. The high phosphate concentrations were used to maintain a stable pH in the cultures. In the second series of experiments, the effects of light intensity (100 and 400 μmol m-2 s-1), temperature (25 and 35 °C), and CO2 concentration (3 and 9% v/v) on the growth and biochemical composition of C. reinhardtii cultures were quantified. Finally, the effects of increasing concentrations of calcium (0.068 – 0.68 mM) and magnesium (0.081 – 0.81 mM) on the growth and biochemical composition of microalgae were quantified in the third experiment. The maximum productivity was predicted to be 0.87 g L-1 d-1 for 5 mM ammonium, 0.65 mM sulfate, and 6% CO2 in the first series of experiments, and this result was confirmed by the model validation experiment. The productivity of the cultures was greatly influenced by increasing CO2 concentrations. The productivity increased significantly (to 1.12 g L-1 d-1) by increasing the light intensity to 400 μmol m-2 s-1 and the temperature to 35 ºC in the second series of experiments. A further increase in productivity to 1.97 g L-1 d-1 was achieved in the third experiment by increasing ten times the concentrations of calcium and magnesium in the medium in relation to the medium used in the two first series of experiments. The biomass yield was positively influenced by the ammonium and sulfate concentrations, as well as by their interaction, but to a less extend by the CO2 concentration. The maximum biomass yield measured in the first series of experiments was 1.57 g L-1 and it was 1.35 g L-1 in the second series of experiments. The concentrations of calcium (0.068 mM) and magnesium (0.081 mM) in the growth media used in these cultures were shown to be limiting for growth over a biomass of about 1 g L-1, as we obtained a biomass of 4.83 g L-1 by increasing ten times the concentrations of calcium and magnesium. The maximum predicted contents of starch and protein were quite high in the first series of experiments: 55 and 65% of dry weight, respectively. These results were confirmed by the model validation experiments. Starch and protein contents varied inversely to each other as response to varying growth medium composition. High concentrations of ammonium and sulfate enhanced protein accumulation, while cells grown in media with low concentrations of ammonium and sulfate accumulated starch as a general response to nutrient limitation, even if these two nutrients were not completely depleted from the medium. Both starch and protein contents increased with increasing light intensity in the second series of experiments, although starch did not exceed 11% of dry weight, due to the nutrient sufficiency of the growth medium. The chlorophyll content of the cultures increased with increasing concentrations of ammonium and sulfate in the media of the first series of experiments and with decreasing light intensity and increasing temperature in the second series of experiments. For obtaining cultures with high biomass, high protein, and high chlorophyll contents, we recommend using media with increased concentrations of ammonium, sulfate, calcium, and magnesium. In such cultures, use of a good pH buffer is encouraged. Media with low ammonium content are recommended for cultures with high productivity and starch content. By increasing light intensity (up to 400 μmol m-2 s-1), temperature (up to 35 °C), CO2 (up to 9% v/v), and calcium (to 0.68 mM or higher) and magnesium (to 0.81 mM or higher) concentrations, the productivity and starch content can be further increased.

Hydrogen er en spesiell attraktiv energikilde, siden utslippet ved forbrenning er vanndamp. Grønnalgen Chlamydomonas reinhardtii er i stand til å produsere hydrogen ved mangel på svovel under anaerobe forhold og brukes som modellorganisme for å studere hydrogenmetabolismen hos mikroalger. Det kreves kulturer med høy biomasse for en effektiv hydrogenproduksjon. Den biokjemiske sammensetningen av algene og spesielt innholdet av stivelse, protein og klorofyll er sentrale faktorer som påvirker effektiviteten i hydrogenproduksjonen. Hensikten med dette arbeidet var å studere virkningen av dyrkingsbetingelsene på vekst og biokjemisk sammensetning hos C. reinhardtii dyrket fotoautotroft i batch kulturer. Innholdet av næringsstoffer i dyrkingsmediet, CO2-konsentrasjon tilført algekulturen, belysningsstyrke og temperatur ble studert. Faktoriell design ble brukt som statistisk analyse for å studere hoved- og samspillseffekter av de ulike variablene. Det ble lagt opp tre forsøksserier hvor en studerte pH i kulturene, produktivitet og biomassetetthet, og innholdet av stivelse, protein og klorofyll. I den første forsøksserien, som var et 24 faktorielt forsøk, ble virkningen av ammonium (7.5 og 17.5 mM), fosfat (10.0 og 20.0 mM), sulfat (0.2 og 0.9 mM) og karbondioksid (2 og 5 %) undersøkt. Forsøket ble så utvidet til 25 behandlinger (med 5.0 – 20.0 mM ammonium, 7.5 – 22.5 mM fosfat, 0.1 – 1.0 mM sulfat, og 1.0 – 6.0 % karbondioksid) i en «central composite design» og hvor virkningen av de ulike faktorene ble modellert ved bruk av andregradsligninger. De oppnådde resultatene ble brukt for å optimalisere virkningen på de studerte variablene, som igjen ble testet. Det høye fosfatinnholdet ble tilført for å holde en stabil pH i kulturene. I den andre forsøksserien ble virkningen av belysningsstyrke (100 og 400 μmol m-2 s-1), temperatur (25 og 35 °C) og CO2 (3 og 9 %) på vekst og biokjemisk sammensetning undersøkt. I den siste forsøksserien undersøkte en virkningen av kalsium (0.068 – 0.68 mM), og magnesium (0.081 – 0.81 mM), på vekst og biokjemisk innhold i C. reinhardtii. Den maksimale veksthastigheten ble beregnet til 0.87 g L-1 d-1 ved bruk av 5 mM ammonium, 0.65 mM sulfat og 6% CO2 i den første forsøksserien og resultatene ble bekreftet i testforsøk. Produktiviteten til C. reinhardtii økte ved økende tilførsel av CO2. Produktiviteten økte signifikant (til 1.12 g L-1 d-1) ved å øke belysningsstyrken til 400 μmol m-2 s-1 og temperaturen til 35 ºC. En videre økning i produktiviteten til 1.97 g L-1 d-1 ble oppnådd i den tredje forsøksserien med å ti-doble kalsium og magnesium konsentrasjonen i forhold til innholdet i mediet brukt i de to første forsøksseriene. Maksimal biomasse ble påvirket av konsentrasjonen av både ammonium og sulfat, så vel som samspillet mellom disse, men noe mindre av CO2-tilførselen. Den maksimale biomassetettheten oppnådd i den første forsøksserien var 1.57 g L-1 og 1.35 g L-1 i forsøksserie to. Konsentrasjonen av kalsium (0.068 mM) og magnesium (0.081 mM) brukt i disse forsøksseriene viste seg å være for liten når tettheten i kulturene oversteg ca. 1 g L-1, og det ble oppnådd en tetthet på 4.83 g L-1 ved å ti-doble disse konsentrasjonene. Det maksimalt beregnede innholdet av stivelse og protein var meget høyt i den første forsøksserien, henholdsvis 55 og 65 % av tørrvekten. Disse resultatene ble bekreftet av testforsøkene. Innholdet av stivelse og protein i algene var negativt korrelert og reagerte forskjellig avhengig av sammensetningen av mediet. Høy konsentrasjon av ammonium og sulfat i dyrkingsmediet fremmet innholdet av protein, mens lav konsentrasjon av ammonium og sulfat førte til betydelig økning av stivelse, selv om det var en del igjen av disse stoffene i dyrkingsmediet. Både stivelse og proteininnholdet i algene økte med økende belysningsstyrke i forsøksserie to, men innholdet av stivelse oversteg ikke 11 % av tørrvekten, trolig fordi det var rikelig med ammonium og sulfat i dyrkingsmediet. Klorofyllinnholdet i algene økte med økende innhold av ammonium og sulfat i dyrkingsmediet og var høyest ved lav belysningsstyrke (100 μmol m-2 s-1). For å oppnå kulturer med høy biomassetetthet, høyt innhold av protein og klorofyll bør det anvendes høye konsentrasjoner av ammonium, sulfat, kalsium og magnesium. I slike opplegg er det viktig å bruke gode buffere for å holde en stabil pH i dyrkingsmediet. For å oppnå høy produktivitet og høyt innhold av stivelse, bør konsentrasjonen av ammonium i dyrkingsmediet være på et nivå slik at det oppstår en mangelsituasjon mot slutten av kulturene. Ved å bruke høye belysningsstyrker (opp til 400 μmol m-2 s-1), temperaturer (opp til) 35 °C, konsentrasjon av CO2 (opp til 9 %), kalsium (0.68 mM) og magnesium (0.81 mM) vil produktiviteten og stivelsesinnholdet kunne økes ytterligere.