Optimización de un sistema de transformación genética de Aspergillus niger como herramienta para su estudio molecular en biotecnología

Universidad Nacional Agraria La Molina. Facultad de Ciencias. Departamento Académico de Biología

En el presente trabajo se evaluaron dos procedimientos de transformación genética en Aspergillus niger, un procedimiento empleando protoplastos para una transformación mediada por polietilenglicol y otra metodología usando electroporación de conidias. Para el método de electroporación no se consiguieron resultados satisfactorios con los tratamientos evaluados. Se probaron diferentes voltajes y tiempos de exposición, sin mbargo no se obtuvo transformantes en ninguno de los casos, y debido a esto los esfuerzos se centraron en desarrollar una metodología basada en el uso de protoplastos. En este otro método alternativo se trabajó la formación de protoplastos a partir de un micelio joven. Se evaluaron diferentes factores como el tiempo de cultivo del micelio que fue establecido a 14 h, el tiempo de reacción enzimática que fue determinado a 90 min, así como las condiciones de recuperación y regeneración de protoplastos. Una vez definida la metodología de formación de protoplastos, se estableció un procedimiento para la trasformación génica mediado por polietilenglicol usando el plásmido integrativo pBF101_hph. En esta segunda etapa, se verificó que el uso de la forma linealizada del vector mejora la eficiencia de transformación comparado al uso de la forma circular. Además, se evaluaron dos procedimientos de selección, sin y con sobrecapa de agar (directa e indirecta), de los transformantes en un medio de cultivo conteniendo higromicina, estableciendo que la selección directa reduce el número de falsos positivos. De esta forma, como resultado de la investigación realizada, se presenta una metodología adecuada para la transformación de la cepa Aspergillus niger ATCC 10846 como una herramienta para su manipulación genética y para su estudio a nivel molecular

In this study, two genetic transformation procedures were evaluated for Aspergillus niger, protoplast mediated transformation (PMT) and electroporation transformation. In electroporation, satisfactory results were not achieved with the evaluated treatments. Different voltages and exposure times were tested, however, no transformant was obtained in any of the cases, and due to that, our efforts were focused on developing a methodology based on the use of protoplasts. In PMT, protoplast formation from young mycelium was evaluated. Different factors were studied, such as the mycelium culture time, which was optimal at 14 h; the enzymatic reaction time, which was better at 90 min, as well as the recovery and regeneration conditions of the protoplasts. Once the protoplast formation methodology was defined, a procedure for polyethylene glycol-mediated genetic transformation was established using the integrative plasmid pBF101_hph. In this second stage, we found that using the linearized form of the vector improved the transformation efficiency compared to the use of the circular form. In addition, two selection procedures (direct and indirect) using hygromycin in the culture medium were evaluated, establishing that direct selection reduces the number of false positives. As a result of our work, an adequate methodology to transform protoplasts from the Aspergillus niger ATCC 10846 strain was developed, which could be used for its genetic manipulation and molecular-level studies.