Tuberculosis bovina : transmisibilidad de cepas de Mycobacterium bovis y detección de micobacterias en menudencias comercializadas en bocas de expendio de carne

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias Veterinarias, área Microbiología, de la Universidad de Buenos Aires, en 2019

La tuberculosis bovina, causada por Mycobacterium bovis (M. bovis), es endémica en la Argentina. Su presencia en el ganado bovino representa un riesgo para la salud humana debido a su carácter zoonótico, pudiendo además afectar a diversos mamíferos. En el hombre, M. bovis causa enfermedad con presentación pulmonar o extrapulmonar siendo la clínica indistinguible de la producida por Mycobacterium tuberculosis. Los más expuestos son los niños que consumen leche o sus derivados sin pasteurizar, los adultos relacionados con la actividad laboral pecuaria y también los cazadores. Para evitar la llegada del agente al consumidor, una de las últimas barreras de protección es la inspección bromatológica en el frigorífico para poder detectar lesiones compatibles con tuberculosis y decomisar los órganos afectados y si está generalizado la res completa. Se realiza visualmente y por palpación, pero debido a la patogenia de la tuberculosis, sólo las lesiones crónicas pueden ser evidenciadas por este monitoreo. La micobacteria puede estar presente incluso en tejidos sin lesión aparente, siendo los principales órganos afectados los linfonódulos y los pulmones, pudiéndose encontrar en otros órganos parenquimatosos como el hígado. Esto puede conducir a escapes del sistema de vigilancia permitiendo que las micobacterias lleguen a los comercios y posteriormente al consumidor. En este trabajo fueron recolectados 210 pulmones junto con los linfonódulos orrespondientes y 6 hígados bovinos, provenientes de un frigorífico y de 6 carnicerías de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y de la provincia de Buenos Aires. Los pulmones recolectados en el frigorífico fueron inspeccionados in situ y se tomaron muestras del órgano para el trabajo en el laboratorio. Los pulmones e hígados que fueron comprados completos en carnicerías y fueron inspeccionados en el laboratorio. Se obtuvieron un total de 5 aislamientos de M. bovis en medio Stonebrink confirmados por PCR IS-6110 (aislamientos N° 134, 719, 179, 182 y 184) y además 12 aislamientos de micobacterias no tuberculosas confirmadas por la secuenciación de los genes hsp65, rpoB, 16S ARNr y secuenciación genómica de alto rendimiento para uno de ellos. Los aislamientos de M. bovis fueron caracterizados molecularmente por Spoligotyping y MIRU-VNTR. Se pudieron distinguir 3 patrones de Spoligotyping que se correspondieron con 3 patrones de MIRU-VNTR, 3 aislamientos compartieron ambos patrones y los otros 2 fueron únicos. Adicionalmente, se investigó en 3 de los aislamientos su capacidad de resistencia a drogas utilizadas en el tratamiento de la tuberculosis en humanos (rifampicina, isoniazida, etionamida, levofloxacina y estreptomicina), encontrándose que el aislamiento 184 era resistente a isoniazida y el aislamiento 134 era multirresistente (presentando resistencia a los 4 antibióticos probados y considerado ?border? para levofloxacina). Se realizó la secuenciación completa del genoma de uno de los aislamientos identificado como M. kansasii empleando una plataforma Illumina mySeq. El genoma fue anotado y se describió sus características así como también se evaluó la presencia de single nucleotide polymorphism (SNPs) en genes de virulencia y genes relacionados a la resistencia a antibióticos y codificantes de antígenos empleados para el diagnóstico de tuberculosis. Se evaluó la virulencia y transmisibilidad de los aislamientos N° 134 y 182 junto con una cepa de referencia M. bovis AN5 (considerada de virulencia intermedia), en un modelo murino. Los animales fueron inoculados intratraquealmente, con 1x105 UFC de cada una de las cepas a evaluar, y dichos animales se pusieron en contacto con ratones sin inocular en una relación 1:1. Se evaluó la virulencia en los animales inoculados, mientras que en los contactos sanos, se evaluó la transmisibilidad de las cepas. Se realizó la eutanasia de 5 animales infectados y 5 animales contactos sanos de cada grupo, en los tiempos 30, 60 y 90 días post-inoculación. Se cultivaron los pulmones y bazos de todos los animales infectados y los contactos sanos en los medios apropiados, evaluando su crecimiento semanalmente. Adicionalmente, los bazos fueron procesados para cuantificar las citoquinas IL-4, TNF ? e INF? por citometría de flujo mediante el kit comercial Cytometric bead array. El aislamiento N° 134 demostró ser virulento por producir sintomatología incompatible con la vida al día 16 posterior a la inoculación, produciendo la muerte de 9 animales, los 6 restantes fueron eutanasiados. El aislamiento N° 182 generó esplenomegalia en los ratones infectados, pero no se observó el desmejoramiento ni la muerte de los animales. Además, se pudo describir la transmisibilidad del aislamiento 182, mediante el aislamiento de la micobacteria a partir de bazo de uno de los animales ?contacto?. A partir del presente trabajo se pudo detectar la presencia de micobacterias tanto zoonóticas como ambientales en vísceras comercializadas. La virulencia, transmisibilidad y la resistencia a antibióticos de cada una de ellas fue variable, requiriéndose de estudios futuros para una mejor comprensión del impacto de estas observaciones en la dinámica de la enfermedad tanto en el ámbito veterinario como en Salud pública.

Bovine tuberculosis, a disease caused by Mycobacterium bovis (M. bovis), is endemic in Argentine. Its presence in cattle represents a risk to human health, due to its zoonotic nature and can also affect various mammals. In human beings, M. bovis causes disease with pulmonary or extrapulmonary presentation, being the clinical manifestation undistinguishable from that produced by M. tuberculosis. The most exposed are children who consume unpasteurized milk or its products, adults who works with livestock and also hunters. To avoid the arrival of the agent to the consumer, one of the main barriers of protection are the carcasses post-mortem inspection at the slaughterhouse, to detect and confiscate organs with lesions compatible with tuberculosis or even the hole animal. Inspection is performed visually and by palpation of the bovine organ, but due to the pathogenesis of the Mycobacterium, only the chronic lesions can be evidenced in this inspection. The Mycobacterium might be present even in tissues without apparent lesion, being the lymph nodes and the lungs, the most affected organs: Other parenchymal organs such as the liver could also be affected. This can lead to escapes of the surveillance system allowing the Mycobacteria to reach the stores and hence, arrive to the consumer. In this study, 210 lungs along with the corresponding lymph nodes and 6 bovine livers were collected, in one slaughterhouse and 6 butchers´ shops in the city of Buenos Aires and the great Buenos Aires area. The lungs collected in the slaughterhouse were inspected in situ and small portions of them were taken. Complete lungs and livers that were bought in butchers´ shops and were then inspected in the laboratory. A total of 5 isolates of M. bovis were obtained in Stonebrink medium and its identity confirmed by PCR IS-6110 (isolates number 134, 719, 179, 182 and 184). Additionally 12 non-tuberculous mycobacteria were isolated and confirmed by the sequencing of the hsp65, rpoB and 16S rRNA genes. The isolates of M. bovis were molecularly characterized by Spoligotyping and MIRU-VNTR. We could differentiate 3 Spoligotyping patterns that corresponded with the 3 patterns of MIRU-VNTR obtained. Three isolates shared both patterns and the other 2 were unique. Additionally, drug resistance to human treatment commonly used drugs (rifampicin, isoniazid, ethionamide, levofloxacin and streptomycin) was investigated in all M. bovis isolates, and it was found that isolate number 184 was resistant to isoniazid and isolate number 134 was multi-resistant (showing resistance to the 4 antibiotics tested and considered "border" for levofloxacin). One non-tuberculous mycobacteria isolates from which good quality DNA was obtained was completely sequenced (whole genome equencing). The genome was annotated and its characteristics were investigated as well as the presence of single nucleotide polymorphism (SNPs) in virulence genes and genes related to resistance to antibiotics and antigens used for diagnosis. The virulence and transmissibility of isolates number 134 and 182 were evaluated together with a reference strain M. bovis-AN5 (considered of intermediate virulence), in an experimental assay in a mouse model. A total of 99 BALB/c female mice aged 5 weeks, were separated in 3 groups of 33 animals each. In turn, each group was divided into 6 cages, the first cage with 3 animals and the remaining cages with 6 animals. All animals in cage number 1 of each group and 3 from each of the remaining cages, were intratracheally inoculated under sedation with isoflurane, with 1x105 CFU of each of the strains to be evaluated, suspended in 100 ?L of PBS, keeping the relationship between inoculated animal and healthy contact 1:1. Virulence was evaluated in those animals that were inoculated, while in the healthy contacts that were living with the infected animals the transmissibility of the strains was investigated. Euthanasia of 5 infected animals and 5 healthy contact animals of each group were performed at times 30, 60 and 90 days post-inoculation. The lungs and spleens of all infected animals and healthy contacts were cultured. The cultures were grown at 37°C for up to 2 months, with weekly evaluation of their growth. Spleens were further processed to measure the cytokines IL-4, TNF? and INF? with the use of a commercial Cytometric bead array kit. Strain number 134 showed to be virulent because it produced symptoms incompatible with life on day 16 after inoculation, producing the death of 9 animals, the remaining 6 were euthanatized and processed. Strain number 182 generated spleen enlargement in the infected mice, but it did not generate the illness or death of any of them. The transmissibility of strain 182 could be evidenced, due to the observation of the growth of colonies from a spleen of a contact animal in the time of euthanasia 90 days after inoculation It was possible to detect the presence of both, zoonotic and environmental mycobacteria, in commercialized viscera. The virulence, transmissibility and drugresistance of the M. bovis strains was variable, requiring future studies for a better understanding of the dynamics of the disease.

Instituto de Biotecnología

Fil: Marfil, Maria Jimena. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina