Factores bioquímicos que controlan la rizogénesis adventicia de la yerba mate (Ilex paraguariensis st. Hil. Aquifoliaceae)

La yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hil) es una especie leñosa, dioica que se cultiva para la utilización de hojas y tallos jóvenes, con los cuales se prepara una infusión llamada mate, apreciada por sus propiedades estimulantes. Las plantaciones actuales provenientes de plantas de semillas presentan una gran heterogeneidad en relación a la productividad y homogeneidad del producto a cosecha y su condición de leñosa, con gran cantidad de sustancias fenólicas, hace dificultosa la propagación vegetativa. La hipótesis planteada fue que diferentes factores fisiológicos condicionan la expresión de la rizogénesis adventicia en la yerba mate, los que en forma aisladas o en sinergia con otros, determinaran el éxito del proceso morfogenético. Considerando esto, el objetivo general de la presente tesis fue determinar la influencia de los principales factores potenciales involucrados en la rizogénesis adventicia de micro- y macro-estacas de Ilex paraguariensis, su participación a lo largo de las fases de enraizamiento, las interrelaciones y las posibles utilizaciones para la construcción de protocolos de propagación. Fue posible optimizar el enraizamiento in vitro mediante la determinación óptima de la concentración de sacarosa, boro y tiempo de duración de la etapa de inducción. La adición de boro dejó en evidencia su relevancia como determinante de proceso, tal vez debido al estar involucrado en la síntesis de los componentes de la pared celular. Un incremento de la concentración de boro durante la fase de inducción permitió obtener un incremento de 12 % de enraizamiento. La medición de las enzimas peroxidasas en la zona de enraizamiento, permitió la separación de las fases del enraizamiento y la determinación de la duración de las mismas, lo que fue corroborado por los estudios histológicos. En este sentido, la desdiferenciación tendría una duración que va del día 0 al 2 (no se observan cambios anatómicos), la iniciación sería alrededor del día 9, mientras que la diferenciación de los primordios se daría cerca del día 10-12 desde el inicio de la inducción. La rizogénesis adventicia de vástagos in vitro y de estaca plurinodales de yerba mate no presentan limitaciones físicas en el crecimiento del primordio de raíz aunque sí orígenes diferentes según se trate de vástagos in vitro (parénquima floematico) o estacas plurinodales (cambium vascular) y esta diferencia en orígenes, según distintos métodos de propagación y explantes (vástagos obtenidos in vitro o esquejes de ramas semi-leñosas) se debería a la capacidad de desdiferenciación de las células presentes en tejidos de distintas edades y su respuesta a la señal de auxina. ii Los ensayos de enraizamiento convencional mediante macro estacas permitieron dilucidar aspectos relevantes para el éxito del mismo. En este sentido, se determinó el diámetro óptimo de las estacas, y que el cultivar, la condición de crecimiento en la cual crece la planta dadora (intensidad de radiación PAR), la inducción y el uso de un flavonoide como la Quercetina, tienen un efecto marcado en la respuesta al enraizamiento. La actividad de enzimas peroxidasas durante el curso del enraizamiento adventicio cambia según el tratamiento de inducción, y la adición de Quercetina y Quercetina más ácido indolbutírico (IBA) producen un aumento de la actividad y una mejora del sistema radical, probablemente como consecuencia de una mayor concentración de formas libres de hormonas auxínicas. El contenido de fenoles en las plantas dadoras de estacas limita la respuesta a la rizogénesis, independientemente del genotipo o edad de la planta por propiciar la muerte oxidativa de los esquejes antes de que el proceso de rizogénesis tenga lugar. En este sentido las condiciones de crecimiento de las plantas dadoras de estacas bajo reducida radiación permite mejorar sustancialmente la tasa de enraizamiento y sobrevivencia de estacas como consecuencia de una reducción del contenido de fenoles totales de cual determinará una menor oxidación. Si bien es conocido, en muchas especies leñosas, la disminución de la respuesta rizogénica en plantas adultas debido a la maduración y el cambio de fase, la respuesta al enraizamiento en individuos adultos de yerba mate no se correlacionaría con la edad sino con el cultivar lo cual nos permitió determinar cultivares contrastantes en lo referido a su capacidad de enraizamiento. Un protocolo de propagación agámica de individuos adultos de yerba mate mediante enraizamiento convencional debería contemplar bajos niveles de radiación durante el crecimiento de las plantas dadoras de esquejes, estacas de diámetro pequeño (semi-leñosas), pre-tratamientos con Quercetina 500 μmolar por una hora, tratamientos inductivos con IBA 4000 ppm en solución alcohólica por 5 minutos, y genotipos con elevada capacidad de enraizamiento.

The yerba mate (Ilex paraguariensis St. Hil) is a woody dioic species cultivated for its leaves and young shoots, which are used to prepare an infusion with stimulating properties known as mate. Existing cultivations, originated from seeds, exhibit large heterogeneity regarding productivity and quality of the harvested material; moreover, their woody nature with a high phenolic content, hinders their vegetative propagation. The proposed hypothesis was that several physiological factors condition the expression of adventitious rhizogenesis in yerba mate and that, acting alone or together with other factors, would determine the outcome of the morphogenic process. Considering this, the general objective of the thesis was to determine the influence of the main factors potentially involved in adventitious rhizogenesis of micro- and macro-cuttings of Ilex paraguariensis, their role along the rooting phases and their possible use to develop propagation protocols. In vitro rooting was possible by determining the optimal sucrose and boron concentration as well as the length of the induction phase. Boron addition revealed its relevance for rooting induction, maybe due to its involvement in the synthesis of cell wall components. An increase in boron concentration during the induction phase allowed a 12% increase in rooting. Peroxidases measurement in the rooting zone made it possible to separate the rooting phases and their length, which was confirmed with histological studies. The dedifferentiation would take place from day 0 to day 2 where no anatomical changes are observed, root primordia initiation would occur around day 9 and primordia differentiation with a visible vascular connection would take place around days 10 to 12 from the start of the induction. Adventitious rhizogenesis from in vitro shoots and plurinodal cuttings of yerba mate has no physical limitation for root primordia growth even when their origins are different: phloematic parenchyma for in vitro shoots and vascular cambium for cuttings. This origin difference would be due to the dedifferentiation ability of cells from tissues of different age and to their response to the auxin signal. Conventional rooting assays using macro-cuttings made it possible to understand some aspects relevant for its success. In this sense, optimal diameter of cuttings was determined and it was observed that the cultivar, growth conditions of the mother plant (PAR radiation), induction and use of a flavonoid like quercetin have a marked effect in the rooting response. Peroxidases activity in adventitious rooting changes according to iv the induction treatment, and the addition of quercetin and quercetin plus indole butyric acid (IBA) result in an increase in their activity and an improvement of the root system development, as a consequence of an increase in free auxin content. The phenolic compounds content of mother plants limits the rhizogenic response independently from the genotype or age of the plant, because it causes oxidation of the cuttings before the rooting takes place. Interestingly, the growth of mother plants under low radiation allows a substantial improvement of rooting rates and the survival of cuttings as a consequence of a reduced phenolic content and, therefore, less oxidation. Even though it is known that there is a reduction in rooting rates as a result of aging and phase change in many woody species, the rooting response in adult plants of yerba mate would not be related to age but to cultivar, which lead us to the identification of contrasting cultivars regarding their ability to root. An agamic propagation protocol from adult plants of yerba mate through conventional rooting should consider keeping mother plants under low radiation levels, cuttings with small diameter (semi-woody), 1-hour treatments with quercetin 500 μmolar, inductive treatments with IBA 400 ppm in alcoholic solution for 5 minutes, and the use of genotypes with high rooting ability.