A simple method for high molecular-weight genomic DNA extraction suitable for long-read sequencing from spores of an obligate biotroph oomycete
2020
Penouilh-Suzette, Charlotte | Fourré, Sandra | Besnard, Guillaume | Godiard, Laurence | Pecrix, Yann | Laboratoire des Interactions Plantes Microbes Environnement (LIPME) ; Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE) | Génome et Transcriptome - Plateforme Génomique (GeT-PlaGe) ; Plateforme Génome & Transcriptome (GET) ; Génopole Toulouse Midi-Pyrénées [Auzeville] (GENOTOUL) ; Université Toulouse III - Paul Sabatier (UT3) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT) ; Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE)-Université Toulouse III - Paul Sabatier (UT3) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT) ; Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE)-Génopole Toulouse Midi-Pyrénées [Auzeville] (GENOTOUL) ; Université Toulouse III - Paul Sabatier (UT3) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT) ; Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE)-Université Toulouse III - Paul Sabatier (UT3) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (ENVT) ; Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National Polytechnique (Toulouse) (Toulouse INP) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE) | Evolution et Diversité Biologique (EDB) ; Institut de Recherche pour le Développement (IRD)-Université Toulouse III - Paul Sabatier (UT3) ; Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Communauté d'universités et établissements de Toulouse (Comue de Toulouse)-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) | Peuplements végétaux et bioagresseurs en milieu tropical (UMR PVBMT) ; Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (Cirad)-Institut de Recherche pour le Développement (IRD)-Université de La Réunion (UR)-Institut National de Recherche pour l’Agriculture, l’Alimentation et l’Environnement (INRAE) | Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (Cirad) | This work was supported by the French ANR grant EFFECTOORES (ANR-13-ADAP-0003) and by the Inter-Units grant EVOPLASMO funded by the French Laboratory of Excellence project TULIP (LabexTULIP, ANR-10-LABX-41; ANR-11-IDEX-0002-02) and the Agrobiosciences, Interactions and Biodiversity Research Federation (FRAIB, FR3450). We thank the Sunflower Biological Resources Centre of the French National Institute for Agricultural Research (INRAE) forproviding sunflower seeds. We thank the Get-PlaGe platform for DNA measurements and sequencing, and the LIPM Bioinformatics platform for performing metrics calculations. GB is member of the EDB laboratory supported by the French Laboratory of Excellence project CEBA (LabexCEBA,ANR-10-LABX-25-01) and LabexTULIP, managed by theFrench ANR. | Sunflower Biological Resources Centre of the French National Institute for Agricultural Research | ANR-13-ADAP-0003,EFFECTOORES,Exploitation des connaissances sur les effecteurs des Oomycetes pour la recherche de résistances durables aux maladies chez les plantes cultivées(2013) | ANR-10-LABX-0041,TULIP,Towards a Unified theory of biotic Interactions: the roLe of environmental(2010) | ANR-10-LABX-0025,CEBA,CEnter of the study of Biodiversity in Amazonia(2010)
International audience
اظهر المزيد [+] اقل [-]إنجليزي. Long-read sequencing technologies are having a major impact on our approaches to studying non-model organisms and microbial communities. By significantly reducing the cost and facilitating the genome assembly pipelines, any laboratory can now develop its own genomics program regardless of the complexity of the genome studied. The most crucial current challenge is to develop efficient protocols for extracting genomic DNA (gDNA) with high quality and integrity adapted to the organism of interest. This can be particularly complex for obligate pathogens that must maintain intimate interactions inside infected host tissues. Here we propose a simple and cost-effective method for high molecular weight gDNA extraction from spores of Plasmopara halstedii, an obligate biotroph oomycete pathogen responsible for downy mildew in sunflower. We optimized the yield, the quality and the integrity of the extracted gDNA by fine-tuning three critical parameters, the grinding, the lysis temperature and the lysis duration. We obtained gDNA with a fragment size distribution reaching a peak ranging from 79 to 145 kb. More than half of the extracted gDNA consisted of DNA fragments larger than 42 kb, with 23% of fragments larger than 100 kb. We then demonstrated the relevance of this protocol for long-read se-quencing using PacBio RSII technology. With this protocol, we were able to obtain a mean read length of 9.3 kb, a max read length of 71 kb and an N50 of 13.3 kb. The development of such DNA extraction protocols is an essential prerequisite for fully exploiting technologies requiring high molecular weight gDNA (e.g. long-read sequencing or optical mapping). These technological advances will help generate data to answer questions such as the role of newly duplicated gene clusters, repeated regions, genomic structural variations or to define number of chromosomes that still remains undefined in many species of pathogenic fungi and oomycetes.
اظهر المزيد [+] اقل [-]الكلمات المفتاحية الخاصة بالمكنز الزراعي (أجروفوك)
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تم تزويد هذا السجل من قبل Institut national de la recherche agronomique