Carga parasitaria, distribución espacial, y diversidad genética de Leishmania spp en personal militar del Ejército Nacional de Colombia con Leishmaniasis cutánea | Parasitic load, spatial distribution, and genetic diversity of Leishmania spp in military personnel of the Colombian National Army with cutaneous Leishmaniasis

Antecedentes: Las leishmaniasis son un grupo de enfermedades de transmisión vectorial causada por parásitos protozoarios del género Leishmania transmitido por insectos flebótomos hembras. Dentro de las manifestaciones clínicas de la enfermedad está la leishmaniasis cutánea (LC), mucocutánea (LMC) y visceral (LV). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las leishmaniasis están presentes en 98 países, con una incidencia de 1,3 millones de casos anuales. En Colombia, el 98% de los casos reportados corresponden a LC y de estos, alrededor del 50% corresponden a pacientes de las Fuerzas Militares debido a sus operaciones en áreas endémicas. Actualmente, en el Ejército Nacional de Colombia se lleva un estricto seguimiento clínico al tratamiento con antimoniato de meglumina, sin evidencia científica de la resolución de la enfermedad por métodos moleculares, lo que conlleva a eventos adversos por fallas terapéuticas o recidivas, generando altos costos en la logística Militar. Objetivos: Los objetivos del estudio fueron cuantificar la carga parasitaria, evaluar la efectividad del tratamiento (1er esquema antimoniato de meglumina y 2do esquema isetionato de pentamidina) mediante métodos moleculares y determinar la distribución, y diversidad genética de Leishmania spp en personal militar del Ejército Nacional de Colombia con leishmaniasis cutánea entre el 2017 – 2019. Metodología: Se recolectaron muestras de frotis / biopsia y sangre periférica en 136 pacientes con LC. El ADNk del minicírculo se amplificó mediante qPCR. Se realizaron pruebas no paramétricas y análisis de componentes principales (ACP) con datos clínico-epidemiológicos y moleculares. Las especies de Leishmania se identificaron mediante BLASTn de acuerdo con las secuencias de HSP70 y MPI. La distribución geoespacial de los parásitos identificados se determinó según el posible sitio de infección. Se construyeron árboles genéticos por verosimilitud máxima (VM), se estimaron índices de diversidad (π, h) y se construyó una red de haplotipos bajo el algoritmo Templeton-Crandall-Sing para determinar las relaciones geográficas de las variantes genéticas de las especies de Leishmania que circulan en la población militar colombiana. Resultados: El 83,09% de los pacientes al finalizar el tratamiento presentaron cargas parasitarias < 10000 parásitos/106 células humanas en frotis/biopsia y < 1,0 parásitos/106 células mononucleares en sangre periférica. Adicionalmente, se determinaron diferencias significativas (P < 0,05) entre las cargas parasitarias de acuerdo con el seguimiento del tratamiento, especie infectante y resolución médica. El ACP explicó la varianza de los datos entre tipo de tratamiento y resolución médica al finalizar el mismo (KMO= 0,432 y Chi2= 55,28**). Se logró identificar las especies infectantes en el 79,4% de las muestras, con la mayor abundancia relativa de L. braziliensis 65,09%, seguida de L. panamensis 31,13%, L. naiffi reportada por primera vez en Colombia en dos pacientes (1,89%) y L. lindenbergi en un solo paciente (0,945%) notificado con LC en el municipio de Miraflores, Guaviare y L. infantum en un solo paciente (0,945%) notificado con LC en el municipio de Tumaco, Nariño. El análisis filogenético fue más consistente en HSP70 frente a MPI, mostrando cuatro clados fuertemente diferenciados en el primer caso. Se estimó una diversidad genética mayor en MPI que en HSP70. Según MPI, π > en L. braziliensis que en L. panamensis, mientras h > L. braziliensis frente a L. panamensis. Conclusiones: En conclusión, a través del seguimiento se demostró la eficacia de la cuantificación de la carga parasitaria para evaluar el pronóstico de la LC, así como de los tratamientos farmacéuticos mostrando una disminución significativa de la carga parasitaria. La distribución sugirió que L. braziliensis tiene una mayor abundancia, mientras que L. panamensis tiene una mayor dispersión. Las relaciones filogenéticas de especies de Leishmania en personal militar colombiano se estimaron con la confirmación de dos nuevas especies circulando sin reporte previo en el país y una especie sin antecedentes de LC en el Ejército Colombiano. Finalmente, L. braziliensis presentó una diversidad genética sustancial. Palabras claves: Leishmania spp., leishmaniasis cutánea, carga parasitaria, antimoniato de meglumina, isetionato de pentamidina, ADNk, HSP70, MPI, filogenética, diversidad genética, Ejército Nacional de Colombia.

Grupo de investigación en Enfermedades Tropicales del Ejército Nacional- GINETEJ

Magíster en Ciencias Básicas Biomédicas

Maestría

Background: Leishmaniasis is a vector-borne disease caused by a protozoan parasite of the genus Leishmania transmitted by female sandfly insects. Among the clinical manifestations of the disease are cutaneous (CL), mucocutaneous (MCL) and visceral (VL) leishmaniasis. According to the World Health Organization (WHO), leishmaniasis is present in 98 countries, with an incidence of 1.3 million new cases annually. In Colombia, 98% of the reported cases correspond to CL and of these, around 50% correspond to patients of the Military Forces due to their operations in endemic areas. Currently, the Colombian National Army carries out strict clinical monitoring of the treatment with meglumine antimoniate, without scientific evidence of the disease resolution by molecular methods, which leads to adverse events due to therapeutic failures or recurrences, generating high costs in Military logistics. Aims: The objectives of the study were to quantify the parasite load, evaluate the effectiveness of the treatment (1st line of meglumine antimoniate and 2nd line of pentamidine isethionate) by molecular methods and determine the distribution as well as the genetic diversity of Leishmania spp in military personnel of the Colombian National Army with cutaneous leishmaniasis between 2017 – 2019. Methods: Smear / biopsy and peripheral blood samples were collected from 136 patients with CL. The minicircle kDNA was amplified by qPCR. Non-parametric tests and principal component analysis (PCA) were performed with clinic-epidemiological and molecular data. Leishmania species were identified by BLASTn according to HSP70 and MPI sequences. The geo-spatial distribution of the identified parasites was determined according to the possible site of infection. Gene trees were constructed by maximum likelihood (ML) and diversity indices (π, h) were estimated and haplotype network was constructed under the Templeton-Crandall-Sing algorithm in order to determine the geographic relationships of the genetic variants of Leishmania species circulating in Colombian military population. Results: 83.09% of the patients at the end of the treatment presented parasite loads <10,000 parasites / 106 human cells in smears / biopsy and <1.0 parasites / 106 mononuclear cells in peripheral blood. Additionally, significant differences (P <0.05) were determined between the parasite loads according to the follow-up of the treatment, infecting species, and medical resolution. The PCA describes the variance of the data between type of treatment and medical resolution at the end of it (KMO = 0.432 and Chi2 = 55.28 **). It was possible to identify the infected species in 79.4% of the samples, with the highest relative abundance L. braziliensis 65.09%, followed by L. panamensis 31.13%, L. naiffi by the first time reported in Colombia in two patients (1.89%) as well as L. lindenbergi in a single patient (0.945%) notified with CL in the municipality of Miraflores, Guaviare and L. infantum in a single patient (0.945%) notified with CL in the municipality of Tumaco, Nariño. The phylogenetic analysis was more consistent in HSP70 versus MPI, showing four strongly differentiated clades in the first case. Greater genetic diversity is estimated in MPI than in HSP70. According to MPI, π > in L. braziliensis than in L. panamensis, while h > L. braziliensis against L. panamensis. Conclusions: In conclusion, through follow-up, the efficacy of the parasite quantification was demonstrated to evaluate the prognosis of CL, as well as the pharmaceutical treatments showing a significant decrease in the parasite load. The distribution suggested that L. braziliensis has a greater abundance, while L. panamensis has a greater dispersion. The phylogenetic relationships of Leishmania species in Colombian military personnel was estimated with the confirmation of two new species circulating without prior report in the country and a species with no background for CL in the Colombian army. Finally, L. braziliensis had a substantial genetic diversity. Keywords: Leishmania spp., cutaneous leishmaniasis, parasitic load, meglumine antimoniate, pentamidine isethionate, kDNA, HSP70, MPI, phylogenetics, genetic diversity, The Colombian National Army.