Construcción de variantes mutantes de la enzima PETasa de Ideonella sakaiensis

La producción indiscriminada de plásticos representa un grave problema para el medio ambiente. El polietileno tereftalato (PET) es uno de los polímeros sintéticos de difícil degradación más comúnmente utilizado; sin embargo, las opciones químicas y físicas para su degradación no son eficientes, ni ecológicas. En la última década, el tratamiento biológico del PET ha despertado gran interés, ya que permite la completa degradación de este polímero y los productos de degradación constituyen materia prima para la elaboración de nuevo PET. En la presente investigación se construyó variantes mutantes de la enzima PETasa de Ideonella sakaiensis en base a un análisis estructural y computacional que permitió diseñar racionalmente variantes que potencialmente permitan incrementar la actividad enzimática sobre el PET. Las mutaciones I208V, N212A y S238Y presentaron gran diferencia de energía de unión, sugiriendo una alta afinidad por el sustrato y baja por los productos de reacción. Se obtuvieron las variantes mutantes mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit QuickChange II, y a través de secuenciación de Sanger se confirmó que al menos dos clones de cada variante poseían la mutación deseada. Los mutantes obtenidos se expresaron en E. coli Rosetta (DE3) bajo condiciones establecidas por medio de ensayo de expresión, 0.1mM de IPTG y 22 grados centígrados durante toda la noche. Las variantes mutantes expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad empleando una columna de Ni-NTA acoplada a un sistema FPLC. Se verificó la presencia de la enzima mediante electroforesis SDS-PAGE.

Indiscriminate plastic production has become a serious environmental problem due to the lack of an efficient treatment. Polyethylene terephthalate (PET) is one of the most used polymers, however chemical and physical options for its degradation are not efficient, neither environmentally friendly. During the last decade, PET biologic treatment has aroused great interest, since it allows the complete degradation of this polymer, and its degradation products work as raw material to produce new PET. Consequently, biological degradation makes it possible to establish a circular system for the use of PET. This investigation built mutant variants of the Ideonella sakaiensis PETase, based on a structural and computational analysis of the enzyme to rationally design variants that potentially increase the enzymatic activity on PET. I208V, N212A and S238Y mutations presented a greater difference in binding energies, suggesting high affinity for the substrate and a low one for the reaction products. Mutant variants were built by site-directed mutagenesis using QuickChange II kit, and through Sanger sequencing it was confirmed that at least two clones of each mutant variant got the desired sequence. Obtained mutations were expressed in E. coli Rosetta (DE3) under expression assay established conditions, 0.1 mM IPTG and 22°C overnight (approx. 15 h). Finally, expressed mutants were purified through affinity chromatography (FPLC) using a Ni-NTA column coupled to an FPLC system. The presence of the enzyme of interest was verified by SDS-PAGE electrophoresis.