Early sex discrimination in Carica papaya L. by molecular cytogenetics | Discriminação sexual no início de Carica papaya L. por citogenética molecular

O mamoeiro, Carica papaya L., é a espécie mais importante economicamente da família Caricaceae. Nativa da América Central e do Sul, esta espécie frutífera e herbácea é cultivada principalmente nas regiões tropicais e subtropicais, e é amplamente consumida pelo seu fruto comestível. C. papaya é caracterizada como uma espécie polígama com três tipos sexuais: macho, fêmea e hermafrodita. Considerando que o mamão é propagado preferencialmente via sementes, problemas inerentes desta cultura se referem à segregação dos tipos sexuais e à detecção sexual tardia. A identificação sexual só é possível após o florescimento, pela inspeção das flores, uma vez que não há dimorfismo cromossômico reconhecido nem diferenças morfológicas entre os três tipos sexuais do mamoeiro no estágio de plântula. Com o objetivo de economizar tempo, manejo e recursos financeiros, é desejável para os produtores que o tipo sexual desta cultura seja conhecido antes do transplantio. Pesquisadores da área de biologia molecular têm desenvolvido um grande número de marcadores genéticos na tentativa de distinguir o sexo do mamão antes de atingir a maturidade reprodutiva. Neste estudo, foram investigados sete marcadores do tipo sequence characterized amplified region (SCAR) previamente descritos na literatura, pela técnica de polymerase chain reaction (PCR), em duas variedades brasileiras comercialmente importantes de C. papaya ( Golden e Rubi ), e então, foi desenvolvido um protocolo de fluorescence in situ hybridization (FISH), usando um marcador selecionado como sonda. Dessa forma, objetivou-se prover um diagnóstico molecular de sexagem precoce para plantas fêmeas e hermafroditas. Primeiramente, DNA genômico foi isolado de folhas jovens coletadas desses dois tipos sexuais de ambas as variedades de mamão. Após a otimização das condições de PCR, amplificações dos sete primers SCAR foram realizadas em sete amostras de cada tipo sexual de cada variedade. Os fragmentos obtidos foram analisados por eletroforese em gel de agarose. Dentre os marcadores genéticos testados, três deles (NAPF-2, SDSP e SCARpm) geraram fragmentos sexo- específicos significativos em todas as amostras hermafroditas de ambos os cultivares de mamão. Outro marcador SCAR (T12) produziu um único fragmento sexo-específico para somente plantas hermafroditas do cultivar Rubi . O marcador NAPF-2 foi escolhido para ser usado como sonda FISH, baseado em seu padrão de bandas consistentemente polimórfico. Análises FISH mostraram um único e forte sinal fluorescente em núcleos de hermafrodita do cv. Golden , e muitos e fortes sinais fluorescentes em núcleos de hermafrodita do cv. Rubi , enquanto nenhum sinal fluorescente detectável ou de baixíssima intensidade foi observado em núcleos de fêmea de ambos os cultivares. Em conclusão, o presente trabalho investigou com sucesso, pela primeira vez, o potencial discriminativo de marcadores SCAR em dois cultivares comerciais brasileiros de mamão, e propôs um novo método diagnóstico confiável, eficiente e relativamente rápido, baseado na técnica de FISH, para a identificação precoce de plantas hermafroditas dos cultivares Golden e Rubi . Em estudos futuros, este método poderá ser melhorado para um escaneamento em larga-escala na produção comercial por meio de uma abordagem citométrica de fluxo após FISH em suspensão nuclear.

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The papaya, Carica papaya L., is the most economically important species of the family Caricaceae. Native of Central and South America, this herbaceous and fruitful crop is cultivated mainly in tropical and subtropical regions worldwide, and it is widely consumed for its edible fruit. C. papaya is characterized as a polygamous species with three sex types: male, female and hermaphrodite. Considering its preferred seminiferous propagation, inherent problems of papaya crop refer to the segregation of sex types and late sex detection. The sex identification is only possible after flowering, by inspection of the flowers, since there is no recognized chromosomal dimorphism or morphological difference between the three papaya sex types in seedling stage. In order to save time, labor and financial resources, it is desirable for growers that the sex type of this crop is known before transplanting. Researchers in molecular biology have developed a number of genetic markers in an attempt to distinguish the sex of papaya before reaching reproductive maturity. In this study, it was investigated seven sequence characterized amplified region (SCAR) markers previously described in the literature, by the polymerase chain reaction (PCR) technique, in two commercially important Brazilian varieties of C. papaya ( Golden and Rubi ), and then, it was developed a fluorescence in situ hybridization (FISH) protocol by using a chosen marker as probe. Thus, we aimed to provide a molecular diagnosis of early sexing for the female and hermaphrodite plants. Firstly, genomic DNA was isolated from female and hermaphrodite young leaves of the both papaya varieties. After optimizing PCR conditions, amplifications of the seven SCAR primers were carried out in seven samples of each sex type from each variety. The fragments obtained were analyzed by agarose-gel electrophoresis. Among the genetic markers tested, three of them (NAPF-2, SDSP and SCARpm) generated prominent sex-specific fragments in all hermaphrodite samples of the both papaya cultivars. Another SCAR marker (T12) produced a single sex-specific fragment for only hermaphrodite plants from Rubi cultivar. NAPF-2 marker was selected to be used as FISH probe based on its consistently polymorphic banding pattern. FISH analyses showed a single strong fluorescent signal in Golden hermaphrodite nuclei and many strong fluorescent signals in Rubi hermaphrodite nuclei, while no detectable or very low intensity fluorescence signal was observed in female nuclei from both cultivars. In conclusion, the present study investigated successfully, for the first time, the discriminating potential of SCAR markers in two Brazilian commercial papaya cultivars, and proposed a new, reliable, efficient and relatively fast diagnostic method, based on FISH technique, for early identification of hermaphrodite plants from cultivars Golden and Rubi . In future studies, this method could be improved for a large-scale screening in commercial cultivation by flow cytometric approach after FISH in nuclei suspension.