Purification, characterization and evaluation of the differential expression of proteases produced by Pseudomonas fluorescens | Purificação, caracterização e avaliação da expressão diferencial de proteases produzidas por Pseudomonas fluorescens

The milk contaminating psychrotrophic bacteria produce thermo resistant proteases that hydrolyze milk caseins, resulting in loss of milk quality and yield of dairy products. Studies involving the characterization of these enzymes and the knowledge about the conditions that influence their production and activity are essential for preventing these problems. This work aimed to understand the activity and production of the extracellular protease produced by Pseudomonas fluorescens 07A strain. This enzyme showed to be a metalloprotease inhibited by Cu 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ , Fe 2+ and Mg 2+ , but induced by Mn 2+ and has a molar mass of 49,486 kDa. Partial sequencing of the proteic structure of this enzyme by mass spectrometry allowed the identification of the gene that encodes this protein in the genome of P. fluorescens 07A. The enzyme has 477 amino acids and highly conserved Ca 2+ and Zn 2+ -binding domains, indicating that Ca 2+ , the main ion in milk, is also a cofactor of this enzyme. The enzyme activity is maximum at 37 °C and pH 7.5, b ut it maintains more than 40% activity when subjected to 100 °C for 5 min in ideal medi um and only 14 to 30% in milder heat treatments, which may cause significant problems in the conditions normally used for the processing and storage of milk and dairy products. Low relative expression of protease was observed after 12 h of incubation at 25 °C, when the bacteria is in logarithmic growth phase, compared to its expression in refrigeration temperatures of 4 and 10 °C, when the bacteria is still in lag p hase. Protease production significantly increased (P <0.05) after 24 h at 25 °C and remained constant up to 48 h, when the bacteria remained at stationary phase, indicating that this enzyme could be produced as an adaptive strategy of the bacteria. The casein fractions of reconstituted skim milk were completely degraded as by P. fluorescens 07A, the purified protease or the bacterial extract within seven days of incubation at 25 °C, and to a lesser extent at 10 °C for milk ino culated with the bacteria. Heat treatment at 90 °C for 5 min inactivated the purified enzym e and inhibited its activity in the bacterial extract. This work allowed understanding the biochemical and biological characteristics of the extracellular protease produced of P. fluorescens 07A strain, as well as the conditions that influence its production and activity in milk. These results can help the dairy industry in the search for alternatives for the processing of dairy products to control production and activity of these proteases in milk.

As bactérias psicrotróficas contaminantes do leite produzem proteases termo- resistentes que hidrolisam as caseínas do leite, resultando em perda de qualidade de leite e rendimento de produtos lácteos. Estudos envolvendo a caracterização dessas enzimas e o conhecimento das condições que influenciam sua produção e atividade são essenciais para a prevenção destes problemas. Neste trabalho, uma protease extracelular produzida pela cepa Pseudomonas fluorescens 07A foi purificada para estudos visando o entendimento de sua atividade e produção em diferentes condições. A enzima é uma metaloprotease inibida por Cu 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Hg 2+ , Fe 2+ e Mg 2+ , mas induzida por Mn 2+ e possui massa molar de 49.486 kDa. O seqüenciamento da enzima por espectrometria de massa permitiu identificar o gene que codifica esta protease extracelular no genoma da cepa P. fluorescens 07A. A enzima possui 477 aminoácidos e domínios altamente conservados de ligação a Ca 2+ e Zn 2+ , indicando que Ca 2+ , o principal íon no leite, é também um co-fator dessa enzima. Sua atividade é máxima a 37 oC e pH 7,5, mas ela mantém mais de 40% de atividade quando submetida a 100 oC por 5 minutos em meio ideal e apenas de 14 a 30% quando submetida a tratamentos térmicos mais brandos, podendo causar problemas significativos nas condições normalmente utilizadas para o processamento e armazenamento de leite e produtos lácteos. Foi observada baixa expressão relativa da protease após 12 h de incubação a 25 oC, quando a bactéria encontra-se na fase logarítmica de crescimento, comparado com as temperaturas de refrigeração de 4 e 10 oC, quando a bactéria está ainda em fase lag. A produção da protease aumentou significativamente (P <0.05) em 24 h a 25 oC e permaneceu constante por até 48 h, intervalo em que a bactéria permaneceu em fase estacionária, indicando que a enzima pode ser produzida como uma estratégia adaptativa da bactéria. As frações de caseína de leite desnatado reconstituído foram completamente degradadas pela P. fluorescens 07A, pela protease purificada e pelo extrato da bactéria em até sete dias de incubação a 25 oC, e em menor extensão a 10 °C para a amostra incubada com a bactéria. O tratamento térmico de 90 oC por 5 minutos inativou a enzima purificada e inibiu sua atividade no extrato da bactéria. Este trabalho permitiu compreender as características bioquímicas e biológicas de uma protease extracelular da cepa P. fluorescens 07A, bem como as condições que influenciam a produção de proteases por esta bactéria em leite e sua atividade. Esses resultados podem auxiliar as indústrias de lácteos na busca por alternativas durante o processamento de produtos lácteos visando o controle de sua produção e atividade.