Detecção de genes de exotoxinas em Staphylococcus spp. Isolados de leite cru refrigerado e de leite de vacas com mastite | Detection of exotoxin genes in Staphylococcus spp. isolates from refrigerated raw milk and milk from cows with mastitis

Staphylococcus spp. tem sido frequentemente associado a surtos de origem alimentar, em virtude da capacidade de algumas espécies produzirem enterotoxinas, principalmente Staphylococcus aureus. A identificação laboratorial dessas espécies, bem como dos genes que codificam as enterotoxinas é um fator importante na elucidação de surtos de intoxicação estafilocócica. Dentre os alimentos envolvidos nessas intoxicações estão o leite e seus derivados, principalmente em decorrência da contaminação por patógenos causadores da mastite bovina, em especial Staphylococcus aureus. Assim, para avaliar o potencial toxigênico de isolados de leite, 264 estirpes de Staphylococcus spp., sendo 96 isolados de leite cru refrigerado e 168 isolados de leite de vacas com mastite foram usadas neste estudo. Dessas, 237 foram avaliadas também quanto às suas características morfológicas e à produção de hemolisina, 32 identificadas bioquimicamente por meio do sistema ID 32 Staph (bioMérieux ® ) e 30 avaliadas quanto ao seu caráter de hidrofobicidade. Todas as estirpes foram analisadas pela técnica de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para a pesquisa do gene femA, específico de Staphylococcus aureus, para dez genes que codificam enterotoxinas estafilococicas (sea – sell) e para o gene tst-1 que codifica a Toxina da Síndrome do Choque Tóxico. A análise morfológica foi realizada em ágar Baird-Parker (BP) e observando-se os aspectos das colônias quanto à sua cor, ao tamanho, ao brilho e à formação de halo devido à produção de lecitinase. A produção de hemolisinas foi verificada em ágar sangue. A detecção de genes para exotoxinas, incluindo enterotoxinas e toxina da síndrome do choque tóxico foi realizada utilizando-se primers descritos na literatura, após extração do DNA bacteriano e sua quantificação em espectrofotômetro (GeneQuant Pro, Amersham Biosciences). A amplificação do DNA foi feita utilizando-se sete reações, sendo cinco com primers para dois genes (seg/femA, seh/sei, seb/sell, sea/sed e sec/see) e duas reações com primers para apenas um gene-alvo (selj e tst-1). As amplificações foram feitas em termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems). O cálculo de hidrofobicidade foi realizado pela medição do ângulo de contato entre a superfície bacteriana e três líquidos com diferentes polaridades, incluindo água, formamida e α-bromonaftaleno, sobre uma camada de células vegetativas usando-se o aparelho Goniômtero (Kruss, Germany) e pelo resultado da energia livre global de interação (∆G swsTOT ). A detecção do gene femA indicou que 14 e sete estirpes identificadas previamente como Staphylococcus Coagulase Negativa (SCN) e Staphylococcus Coagulase Positiva (SCP), respectivamente, tratavam-se de S. aureus. Dentre os isolados avaliados morfologicamente em Agar Baird-Parker e identificados bioquímica e molecularmente como S. aureus, apenas 18,7% (38/203) apresentaram colônias típicas. Observou-se que 64,5% (153/237) produziram hemolisina. Quanto às análises realizadas por meio do sistema ID 32 Staph (bioMérieux ® ), 15,6% (5/32) apresentaram identificação diferente daquela realizada por provas bioquímicas tradicionais. Dentre as 264 estirpes analisadas molecularmente, 2,27% eram portadoras do gene tst-1 e foram isoladas de leite de tanque refrigerado. Os genes que codificam a produção de enterotoxinas estafilocócicas, foram verificados em isolados de leite armazenados em tanque de refrigeração e leite de vacas com mastite, ressaltando-se a presença dos genes que codificam a produção das novas enterotoxinas (seg-sell) (96,3%). Todos os isolados (17 isolados de leite proveniente de tanque refrigerado e 13 de leite de vacas com mastite) foram considerados hidrofílicos, tanto em relação à analise quantitativa (∆G adesão > 0), quanto para a análise qualitativa (< 50o). A presença de genes codificadores das enterotoxinas estafilocócicas demonstra a possibilidade de intoxicações e ressalta a importância no controle da mastite bovina bem como no controle da qualidade do leite.

Staphylococcus spp. has been frequently associated with food-borne breakouts, due to the capacity some species have to produce enterotoxins, mainly Staphylococcus aureus. Laboratory identification of these species, as well as of the genes which codify the enterotoxins, is an important factor in elucidating staphylococcus intoxication breakouts. Milk and dairy products are among the foods involved in these intoxications, especially due to contamination by pathogens causing bovine mastitis, mainly Staphylococcus aureus. Thus, to evaluate the toxigenic potential of milk isolates, 264 strains of Staphylococcus spp. were used in this study, i.e., 96 isolates from refrigerated raw milk and 168 isolates from mastitis-infected cows’ milk. Out of these, 237 were also evaluated as to their morphological characteristics and hemolysine production, 32 were identified biochemically by means of the ID 32 Staph (bioMérieux ® ) system and 30 were evaluated as to their hydrophobicity character. All the strains were analyzed by the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique to research the gene femA, specific of Staphylococcus aureus, for ten genes that codify staphylococcal enterotoxins (sea – sell) and for the gene tst-1 that codifies the Toxic Shock Syndrome Toxin. Morphological analysis was carried out in Baird-Parker (BP) agar, and by observing the colonies’ aspect regarding color, size, shine and halo formation as a result of lecithinase production. Hemolysine production was verified in blood agar. Gene detection for the exotoxins, including enterotoxins and toxic shock syndrome toxin, was carried out using primers described in the literature, after extraction of the bacterial DNA and its quantification in spectrophotometer (GeneQuant Pro, Amersham Biosciences). DNA amplification was performed by using seven reactions, five with primers for two genes (seg/femA, seh/sei, seb/sell, sea/sed and sec/see) and two reactions with primers for only one target-gene (selj and tst-1). The amplifications were carried out in the GeneAmp ® PCR thermal cycler System 9700 (Applied Biosystems). Hydrophobicity was calculated by measuring the angle of contact between the bacterial surface and three liquids with different polarities, including water, phormamide and α-bromonafthalene, on a layer of vegetative cells, using the Goniometer apparatus (Kruss, Germany) and by the result of the global free interaction energy (∆G swsTOT ). Detection of the gene femA indicated that 14 and seven strains identified previously as Staphylococcus Coagulase Negative (SCN) and Staphylococcus Coagulase Positive (SCP), respectively, were identified as S. aureus. Among the isolates morphologically evaluated in Agar Baird-Parker and biochemically and molecularly identified as S. aureus, only 18.7% (38/203) presented typical colonies. It was verified that 64.5% (153/237) produced hemolysine. As for the analyses carried out by the ID 32 Staph (bioMérieux ® ) system, 15.6% (5/32) presented identification different from that using traditional biochemical tests. Among the 264 strains analyzed molecularly, 2.27% were carriers of gene tst-1 and were isolated from refrigerated tank milk. The genes that codify the production of staphylococcal enterotoxins were verified in milk isolates stored in refrigeration tanks and in milk from cows with mastitis, emphasizing the presence of genes that codify the production of the new enterotoxins (seg-sell) (96.3%). All isolates (17 isolates from refrigerated tank milk and 13 from mastitis- infected cows’ milk) were considered hydrophilic, both in relation to quantitative (∆G adhesion > 0), and qualitative (< 50o) analysis. The presence of the genes that codify the staphylococcal enterotoxins shows the likelihood of intoxications and emphasizes the importance of controlling bovine mastitis as well as milk quality.