Diagnostic parameters of Northern blot hybridization technique for detection of citrus viroids in field-grown plants

Background and Objective: The identification and diagnosis of citrus viroids can be achieved by molecular techniques that directly detect the presence of viroid genomes within infected plant RNA pools. Several studies have reported numerous diagnostic parameters for detection of citrus viroids in field-grown plants. Herein, we report an improved molecular technique based on PAGE-Northern blotting with cDNA DIG-specific (non-radioactive) probes that is rapid, reliable and requires low amounts of tissue from field-grown samples. Materials and Methods: Total RNA was extracted from viroid-infected and negative control bark tissue sampled from field-grown citrus cultivars and subjected to DIG-labeled Northern blot molecular procedures. Results: Based on multi-probe viroid RNA hybridization sensitivity analysis, we were able to detect specific viroids with as little as 8-12 mg of fresh tissue. All cDNA DIG-specific probes yielded strong positive signal only when the specific viroid was present. Signal repeatability observed in 25 membranes was robust, with a total of 84 field samples analyzed. Conclusion: Overall, this molecular diagnostic technique, based on PAGE-Northern blot using cDNA-DIG probes, offered rapid, reliable and robust results, allowing for the direct detection of viroids from minute amounts of bark tissue sampled from field-grown citrus plants.

Antecedentes y objetivo: La identificación y el diagnóstico de los viroides de los cítricos se puede lograr mediante técnicas moleculares que detectan directamente la presencia de genomas de viroides dentro de los grupos de ARN de plantas infectadas. Varios estudios han informado numerosos parámetros de diagnóstico para la detección de viroides de cítricos en plantas cultivadas en el campo. En este documento, informamos una técnica molecular mejorada basada en transferencia PAGE-Northern con sondas específicas de cDNA DIG (no radiactivas) que es rápida, confiable y requiere pequeñas cantidades de tejido de muestras cultivadas en el campo. Materiales y métodos: el ARN total se extrajo de tejido de corteza de control negativo e infectado con viroide muestreado de cultivares de cítricos cultivados en el campo y se sometió a procedimientos moleculares de transferencia Northern marcados con DIG. Resultados: Con base en el análisis de sensibilidad de hibridación de ARN de viroide de múltiples sondas, pudimos detectar viroides específicos con tan solo 8-12 mg de tejido fresco. Todas las sondas específicas de cDNA DIG produjeron una fuerte señal positiva solo cuando estaba presente el viroide específico. La repetibilidad de la señal observada en 25 membranas fue sólida, con un total de 84 muestras de campo analizadas. Conclusión: En general, esta técnica de diagnóstico molecular, basada en PAGE-Northern blot usando sondas cDNA-DIG, ofreció resultados rápidos, confiables y sólidos, lo que permitió la detección directa de viroides a partir de cantidades diminutas de tejido de corteza muestreado de plantas de cítricos cultivadas en el campo.

Universidad Nacional, Costa Rica

Escuela de Ciencias Biológicas