Molecular and phenotypic analyses of pathogenicity, aggressiveness, mycotoxin production, and colonization in the wheat-Gibberella zeae pathosystem

Fusarium head blight (FHB), caused by Gibberella zeae (Schwein.) Petch (anamorph: Fusarium graminearum Schwabe), is one of the principal diseases responsible for extensive damage in wheat fields and contamination of grain with the mycotoxins deoxynivalenol (DON) and nivalenol (NIV), rendering the harvest unsafe for human and animal consumption. Control of FHB is difficult because of the complex nature of host-pathogen-environment interaction and the nonavailability of highly effective fungicides. Agronomic practices and resistance breeding, therefore, offer the best strategies for disease management. Mapping by molecular markers provides an accurate approach for genetic analyses of simple and complex traits particularly pathogenicity, aggressiveness, and mycotoxin production. Pathogenicity, as defined here, is the ability to cause disease whereas aggressiveness is the quantity of disease induced by a pathogenic isolate on a susceptible host in which isolates do not interact differentially with host cultivars. The project aims to (1) map pathogenicity and aggressiveness of G. zeae based on a published genetic map (2) estimate genetic diversity of four parent isolates by PCR-based markers (3) examine the inheritance of pathogenicity, aggressiveness, mycotoxin type (DON/NIV), and DON production on a phenotypic basis, (4) analyse genetic covariation among aggressiveness, DON, and fungal colonization, (5) and compare aggressiveness of 42 isolates in greenhouse and field environments. Two crosses of G. zeae using nit (nitrate nonutilizing) marker technique were performed: (1) pathogenic DON-producing Z-3639 (Kansas, USA) x nonpathogenic NIV-producing R-5470 (Japan) belonging to lineage 7 and 6, respectively, and (2) DON-producing FG24 (Hungary) x FG3211 (Germany), both aggressive lineage 7 isolates. For the first cross, 99 progeny segregated in a consistent 61:38 for pathogenicity: nonpathogenicity in a two-year greenhouse experiment. Among the 61 pathogenic progeny, disease severity, measured as percentage infected spikelets, varied significantly (P = 0.01). Heritability for aggressiveness was high. Pathogenicity locus was mapped on linkage group IV near loci PIG1 (red pigment production), TOX1 (trichothecene toxin amount), and PER1 (perithecial production) explaining 60%, 43%, and 51% of the phenotypic variation, respectively. Two large aggressiveness QTLs were mapped on linkage group I linked to the locus TRI5 (trichodiene synthase in the trichothecene gene cluster) and an amplified fragment length polymorphism (AFLP) marker (EAAMTG0655K), explaining 51% and 29% of the observed phenotypic variation, respectively. These unlinked loci suggest that genetic basis between pathogenicity and aggressiveness were different. TRI5 is located in the same gene cluster as a previously identified gene known as TRI13, which determines whether DON or NIV will be produced. DON-producing progeny were, on average, twice as aggressive as were those producing NIV. Loci were only detected in the two linkage groups mentioned from the nine linkage groups present in the map. For the second cross FG24 x FG3211 with 153 progeny, head blight rating and relative plot yield were used as aggressiveness traits. DON production was measured by a commercial kit enzyme immunoassay. These three traits were quantitatively inherited among 153 progeny across three environments. Repeatabilities within each environment were medium to high but heritabilities across environments were medium only due to high progeny-environment interaction. DON was a less environmentally stable trait than aggressiveness. Transgressive segregants were detected frequently. This implies that even a cross within a lineage could lead to an increase in aggressiveness. Mapping of this cross was not initiated because the parents were not polymorphic enough to construct a genetic map. Instead, the parents were analysed for polymorphism in comparison to the parents of the first cross using 31 AFLP primer combinations and 56 random amplified polymorphic DNA (RAPD) primers. Polymorphism between Z-3639 and R-5470 was about three to four times higher than between FG24 and FG3211. Cluster analysis revealed that R-5470 was genetically separated from the other three parents, thus confirming the lineage assignments. Among preselected 50 progeny from the same field experiments that showed normal distribution for aggressiveness - head blight rating, fungal colonization, and DON production were correlated (r = 0.7, P = 0.01). Fungal colonization measured as Fusarium exoantigen (ExAg) content using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) varied also quantitatively, but heritability was lower due to high progeny-environment interaction and error. Strong correlations among all traits indicate control by similar genes or gene complexes. No significant variation was observed for DON/ExAg ratio. Aggressiveness traits and DON production were more environmentally stable compared to Fusarium ExAg content. Our findings imply that aggressiveness may have other components apart from mycotoxin production. Genotypic variation for aggressiveness among the 42 progeny in one greenhouse and three field environments was significant and their correlation was moderate (r = 0.7, P = 0.01). High heritability in both environments again indicates that aggressiveness was a relatively stable trait, although methods of inoculation differed, i.e., injection for greenhouse and spraying for field experiments. Greenhouse aggressiveness could predict aggressiveness in the field, and thereby should reduce costs for resistance and phytopathological studies. In conclusion, we consider G. zeae as medium-risk pathogen with the potential to evolve to a higher level of aggressiveness due to sexual recombination. Erosion of quantitative resistance in FHB cannot be ignored, especially if host resistances with oligogenic inheritance, e.g. Sumai 3 from China, are used on a large acreage. Consequently, the rather simple inheritance of pathogenicity and aggressiveness in G. zeae could lead to a gradual increase of aggressiveness. These results should enhance efforts of plant breeders to use several, genetic distinct sources of resistance in order to avoid possible FHB outbreaks in the future.

Ährenfusariosen, die im Wesentlichen von Gibberella zeae (Schwein.) Petch (anamorph: Fusarium graminearum Schwabe) verursacht werden, können zu hohen Ertragsverlusten und der Kontamination mit Mykotoxinen führen. Hauptsächlich werden die Mykotoxine Deoxynivalenol (DON) und Nivalenol (NIV) produziert, die eine gesundheitsschädigende Wirkung auf Mensch und Tier haben. Wegen der hohen Wirt-Pathogen-Umwelt-Interaktion sowie wenig effizienter Fungizide ist die Bekämpfung von Ährenfusariosen problematisch. Pflanzenbauliche Maßnahmen und Resistenzzüchtung können zu einer Verminderung des Pilzbefalls führen. Die Kartierung mit molekularen Markern bietet die Möglichkeit, sowohl einfach wie auch komplex vererbte Merkmale zu untersuchen. Pathogenität und Aggressivität stellen zwei wichtige Bedingungen der Infektion und der Befallsentwicklung von Ährenfusariosen dar. Pathogenität wird dabei als die Fähigkeit eines Isolats definiert, Krankheitssymptome auf einem anfälligen Wirt hervorzurufen. Aggressivität beschreibt die Stärke des Befalls, wenn die Isolate nicht differentiell mit den Wirtsgenotypen interagieren. Zielsetzung des Projektes war (1) die Kartierung der Pathogenität und der Aggressivität von G. zeae, aufbauend auf einer bereits publizierten genetischen Karte, (2) die Analyse der Diversität aller Eltern-Isolate mit PCR-basierenden Markern, (3) die Untersuchung der Vererbung von Pathogenität, Aggressivität, Mykotoxin-Typ (DON/NIV) und DON-Produktion, (4) die Analyse der genetischen Kovariation zwischen Aggressivität, DON und Myzelwachstum und (5) der Vergleich der Aggressivität von 42 Isolaten im Gewächshaus und Feld. Es wurden zwei Kreuzungen mittels nit (nitrate nonutilizing)-Markern durchgeführt, zum einen wurde das pathogene, DON-produzierende Isolat Z-3639 aus Kansas (USA) mit dem nicht-pathogenen, NIV- produzierenden Isolat R-5470 (Japan) der Abstammungslinien 7 bzw. 6 gekreuzt, zum anderen wurden die beiden DON-produzierenden, aggressiven Isolate FG24 (Ungarn) und FG3211 (Deutschland) der Abstammungslinie 7 gekreuzt. Die 99 Nachkommen der ersten Kreuzung spalteten in einem zweijährigen Gewächshausversuch qualitativ in einem Verhältnis 61:38 für das Merkmal Pathogenität. Die Aggressivität, gemessen als Prozent infizierter Ährchen, variierte signifikant (P=0,01) zwischen den 61 pathogenen Nachkommen. Die Heritabilität für die Aggressivität war in dieser Kreuzung hoch. Die Pathogenität wurde auf der Kopplungsgruppe IV nahe den Loci PIG1 (Pigmentierung), TOX1 (Trichothecen-Gehalt), und PER1 (Perithezienproduktion) lokalisiert. Sie erklärten 60%, 43% bzw. 51% der phänotypischen Varianz. Zwei Loci für die Aggressivität waren auf der Kopplungsgruppe I mit TRI5 (Trichodiensynthase) und einem AFLP- (amplified fragment length polymorphism) Marker (EAAMTG0655K) gekoppelt und erklärten 51% bzw. 29% der phänotypischen Varianz. TRI5 befindet sich im gleichen Gen-Cluster wie TRI13, das über die Bildung von DON oder NIV entscheidet. Die DON-produzierende Teilpopulation war im Durchschnitt zweimal so aggressiv wie die NIV-produzierende Teilpopulation. Es wurden keine weiteren Loci für die Pathogenität oder Aggressivität auf den restlichen sieben Kopplungsgruppen dieser Karte gefunden. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass beide Merkmale in dieser Kreuzung auf unterschiedliche Weise vererbt werden. Für die zweite Kreuzung FG24 x FG3211 mit 153 Nachkommen wurden die Ährenbonitur und das relative Ährengewicht als Merkmal für die Aggressivität in einem Feldversuch über drei Umwelten ermittelt. Zusätzlich wurde die DON-Produktion mittels eines handelsüblichen Immunotestes gemessen. Alle drei Merkmale zeigten eine quantitative Verteilung. Trotz einer mäßigen bis hohen Wiederholbarkeit in den Einzelumwelten, war die Heritabilität in der Serienverrechnung wegen der hohen Genotyp-Umwelt-Interaktion nur mäßig. Die DON-Produktion zeigte eine geringere Umweltstabilität als die Aggressivität. Transgressionen wurden häufig beobachtet. Dies zeigt, dass auch eine Kreuzung innerhalb einer Abstammungslinie zu einer höheren Aggressivität führen kann. Die Kartierung der zweiten Kreuzungsnachkommenschaft konnte nicht durchgeführt werden, weil der Polymorphismus zwischen den Eltern zu gering war. Statt dessen wurden die Eltern dieser Kreuzung mittels 31 AFLP-Primerkombinationen und 56 RAPD- (random amplified polymorphic DNA)-Primern mit den beiden Eltern der ersten Kreuzung verglichen. Der Polymorphiegrad zwischen Z-3639 und R-5470 war etwa drei bis viermal höher als zwischen FG24 und FG3211. Die Cluster-Analyse ergab, dass R-5470 von den anderen drei Eltern genetisch stark verschieden war, wodurch die Zugehörigkeit zu einer anderen Abstammungslinie als die der restlichen Isolate gerechtfertigt werden kann. Bei fünfzig selektierten Nachkommen, die im Feldversuch über drei Umwelten eine Normalverteilung für die Aggressivität zeigten, korrelierten die Ährenbonitur, das Myzelwachstum und die DON Produktion relativ gut (r = 0,7; P = 0,01). Auch das Myzelwachstum, gemessen als Fusarium-Exoantigen (ExAg) mittels ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), variierte quantitativ. Die Heritabilität für dieses Merkmal war jedoch aufgrund der hohen Bedeutung von Genotyp-Umwelt-Interaktion und Fehler niedrig. Die Korrelation zwischen allen Merkmalen zeigt, dass sie von ähnlichen Genen oder Genkomplexen kontrolliert werden. Es wurde keine signifikante Variation für das DON/ExAg-Verhältnis nachgewiesen. Die Aggressivitätsmerkmale und die DON-Produktion waren umweltstabiler als der Fusarium-ExAg-Gehalt. Diese Ergebnisse belegen, dass neben der Mykotoxinproduktion noch andere Merkmale zur Aggressivität beitragen. Die genotypische Variation für die Aggressivität bei 42 Nachkommen im Gewächshaus und an drei Feldumwelten war signifikant (P = 0,01), die Korrelation war mäßig hoch (r = 0,7; P = 0,01). Dies zeigt, dass die Aggressivität stabil vererbt wurde, obwohl zwei unterschiedliche Inokulationsmethoden angewandt worden waren. Die Einzelährcheninjektion im Gewächshaus einerseits und die Sprühinfektion im Feld andererseits. Daher können die Ergebnisse aus den Gewächshausversuchen zur Vorhersage der Aggressivität im Feld genutzt und damit die Kosten für solche Untersuchungen gesenkt werden. Zusammenfassend sollte G. zeae als Pathogen mit einem mittleren Risiko zur Überwindung von Resistenzen eingestuft werden. Allerdings kann evolutionär durchaus ein höheres Aggressivitätsniveau durch sexuelle Rekombination erreicht werden. Die Erosion quantitativer Resistenz bei Ährenfusariosen sollte dabei nicht vernachlässigt werden. Dies gilt besonders dann, wenn Wirtsgenotypen mit oligogenischer Vererbung der Resistenz, wie beispielsweise die chinesische Sorte Sumai 3, einen großen Anteil der Anbaufläche haben. Die einfache Vererbung der Pathogenität und Aggressivität bei G. zeae kann dann zu einer graduellen Erhöhung der Aggressivität führen. Daher sollten Pflanzenzüchter mehrere, genetisch unterschiedliche Resistenzquellen für die Sortenentwicklung nutzen, um in Zukunft größer Epidemien durch Ährenfusariosen zu vermeiden.