Comprehensive analyses of DNA methylation profile, regulation on flowering, and seed mineral accumulation in Arabidopsis thaliana in response to zinc deficiency

Zinc (Zn) is an essential micronutrient for plant growth and development, which plays important roles in DNA binding, metabolic, catalytic and transcriptional regulator activities. However, Zn deficiency is a worldwide problem due to its limited bioavailability in soils in many agricultural areas, often as a result of high CaCO3 content and high pH. In addition, phytic acid is able to strongly chelate cations, such as Zn2+, Fe2+, Ca2+ and Mg2+ to form the phytate salts. Phytate cannot be digested by human beings or other monogastric animals due to lack of phytase, an enzyme that can hydrolyze phytate. Therefore, Zn bioavailability in seeds (or grains) is restricted by phytate. Moreover, seed Zn concentration is also reduced by elevated CO2, especially in C3 plants, such as wheat, rice and soybean. Regarding to the crucial roles but limited bioavailability of Zn, here I present a comprehensive analysis on roots, leaves (and flowering) and seeds in response to Zn deficiency in the model plant Arabidopsis thaliana via three experiments. First, I investigated the transcriptional response and whole-genome DNA methylation profile upon Zn deficiency in roots using next-generation sequencing. Ionome analysis on shoots showed that Zn concentration was strongly reduced in Zn deficiency, whereas other nutrients were not affected. Microarray Analysis identified several known Zn-deficiency responsive genes, confirming the effectiveness of Zn deficiency in this work. However, bisulfite sequencing results revealed that DNA methylation was eliminated by Zn deficiency in transposable elements and slightly in gene bodies as well. The DNA demethylation response to nutrient stress was a novel finding, as reversed to previous reports about phosphate stress which accumulated methylation. Surprisingly, further analysis suggested that DNA methylation occurred independent of gene transcription. Nevertheless, non-CpG methylation has a potential impact on flower development in response to Zn deficiency. The second experiment investigated the relationship between rosette size and flowering, and how rosette size and flowering time were regulated by Zn deficiency. Using natural variation population (168 Arabidopsis accessions), I found that flowering time was positively correlated with rosette size in early-flowering accessions but not in late-flowering accessions. Intriguingly, the flowering time was delayed by Zn deficiency in these early-flowering plants and resulting in promotion of vegetative biomass. However, Zn-regulated flowering time was independent of previously reported flowering pathways. Then genome-wide association study identified the underlying candidate gene was FLOWERING LOCUS T (FT) which was strongly inhibited by Zn deficiency in all accessions. Detailed genetic analysis confirmed this result as well. Furthermore, the promotion of leaf size in Zn deficiency was found being contributed by cell proliferation (cell number) but not cell size. Lastly, in the third experiment I was interested in the natural genetic variation in seed Zn concentration, together with iron (Fe) and manganese (Mn), in response to Zn deficiency. Across around 100 accessions, average seed Zn concentration decreased from 47.4 µg g-1 to 31.3 µg g-1 due to Zn deficiency. To identify candidate genes affecting seed Zn, Fe and Mn concentrations, genome-wide association mapping was performed. A candidate gene, inositol 1,3,4-trisphosphate 5/6-kinase 3 gene (ITPK3), was associated which is involved in phytate synthesis pathways. However, loss of this gene in itpk3-1 did neither affect phytate seed levels nor seed Zn, Fe and Mn. Nevertheless, large natural variance of micronutrient seed levels was identified in the population and several accessions maintained high seed Zn despite growth in Zn-deficient conditions. Altogether, this study presents comprehensive analyses in how Arabidopsis adapts to Zn deficiency in regard of root transcription and DNA methylation, flowering and leaf regulation, and seed mineral accumulation. I provided new possibilities of correlation between DNA methylation and gene transcription, which is much more complex than previously reported. I also opened a novel insight into flowering regulation on leaf size, resulting in promotion of vegetative biomass in nutrient deficiency. Substantial natural variation of seed experiment indicated that the evolution process was involved in seed mineral accumulation in Arabidopsis, especially those accessions maintaining Zn concentration in Zn-deficient soils are valuable for further investigations. I believe these findings in Arabidopsis also provide precious knowledge for plant breeders and agronomists who work on crops. 

Zink (Zn) ist ein essentieller Mikronährstoff für das Wachstum und die Entwicklung einer Pflanze. Seine wesentlichen Funktionen liegen in der Bindung von DNA sowie in metabolischen, katalytischen und transkriptionell regulatorischen Aktivitäten. Aufgrund der begrenzten Bioverfügbarkeit von Zink im Boden, stellt Zinkmangel ein weltweites Problem dar. Vor allem landwirtschaftlich genutzte Böden mit hohen pH-Werten und Kalkgehalten limitieren die Zinkaufnahme. Zusätzlich werden Kationen (wie Zn2+, Fe2+, Ca2+ and Mg2+) von im Boden enthaltenen Phytinsäuren chelatiert und bilden zusammen das schwerlösliche Salz Phytat. Phytat kann nicht von monogastrischen Lebewesen wie dem Menschen aufgespalten werden, da das dazu benötige Enzym Phytase nicht im Verdauungstrakt vorkommt. Die Bioverfügbarkeit von Zn ist deshalb in pflanzlichen Samen durch den Phytatgehalt limitiert. Zudem führt der ansteigende CO2-Gehalt zu einer reduzierten Zn Konzentration im Samen, vor allem in C3-Pflanzen wie Weizen, Reis und Soja. Aufgrund der wichtigen biologischen Funktionen von Zink, aber seiner begrenzten Bioverfügbarkeit, wurden in diesem Forschungsprojekt verschiedene Effekte des Zinkmangels in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana genauer analysiert. Zunächst wurden unter Zinkmangel transkriptionelle Veränderungen per Microarray und das genomweite DNA Methylierungsmuster durch genomweite Bisulfit-Sequenzierung in Wurzeln bestimmt. Dabei zeigte die Ionom-Analyse im Spross eine deutlich reduzierte Zn Konzentration in Zinkmangel-ernährten Pflanzen ohne Veränderungen anderer Nährstoffkonzentrationen. Auch die Microarray-Daten belegten einen spezifischen Zinkmangeleffekt durch Expressionsänderungen von mehreren Zinkmangelgenen. Die Ergebnisse der Bisulfit-Sequenzierung wiesen eine Reduzierung der DNA Methylierung durch Zinkmangel auf, welche, wenn vorhanden, hauptsächlich in Transposonelementen und teilweise in kodierenden Genregionen lokalisiert war. Die hier durch Stress verursachte Demethylierung unterschied sich zu bereits beschriebenen Veränderungen der Methylierung durch Phosphormangel – dies könnte zu neuen Erkenntnissen im Bereich der epigenetischen Anpassung führen. Interessanterweise zeigten weitere Untersuchungen, dass das DNA Methylierungsmuster keinen direkten Einfluss auf die Genexpression hatte. Nicht-CpG-Methylierungen könnten unter Zinkmangel möglicherweise aber die Blütenentwicklung beeinflussen. Im zweiten Experiment wurde der Zusammenhang zwischen Rosettengröße und Blütezeit unter Zinkmangel bei natürlichen Population von Arabidopsis (168 Akzessionen) genauer untersucht: Bei Frühblüher-Akzessionen korrelierte der Blütezeitpunkt positiv mit der Rosettengröße; Dies traf allerdings nicht bei Spätblütler-Akzessionen zu. Zusätzlich wurde bei diesen Frühblütlern ein bis dato unbekannter, verspäteter Blütezeitpunkt unter Zinkmangel beobachtet, welcher zu einem verstärkten vegetativen Wachstum und dadurch zu einer erhöhten Biomasse führte. Das dafür verantwortliche Gen FLOWERING LOCUS T (FT), das unter Zinkmangel in allen Arabidopsis Akzessionen stark inhibiert war, wurde mittels einer genomweiten Assoziationsstudie identifiziert. Des Weiteren konnte das verstärkte vegetative Blattwachstum unter Zinkmangel auf eine erhöhte Zellproliferation (Zellzahl) und nicht auf eine erhöhte Zellgröße zurückgeführt werden. Im letzten Versuch wurde unter Zinkmangel die natürliche genetische Variation der Zn (sowie Fe und Mn) Konzentration in Samen analysiert. In etwa 100 Akzessionen verringerte sich unter Zinkmangel die durchschnittliche Zn Konzentration im Samen von 47.4 µg g-1 auf 31.3 µg g-1. Eine erneute genomweite Assoziationsstudie identifizierte das Inositol 1,3,4-triphosphate 5/6-kinase 3 (ITPK3) Gen, welches in der Phytatsynthese beteiligt ist, als möglichen Kandidaten für die Beeinflussung der Zn, Fe und Mn Konzentration im Samen. Jedoch führte der Verlust dieses Gens in der iptk-1 Mutante weder zu einem verringerten Phytatgehalt noch zu veränderten Zn, Fe oder Mn Konzentrationen im Samen. Trotz Wachstum auf Zinkmangelboden wurde in der untersuchten Arabidopsis Population ein hoher Mikronährstoffgehalt im Samen quantifiziert und mehrere Akzessionen zeigten sogar trotz Zinkmangel einen hohen Zinkgehalt im Samen, was auf eine evolutionäre Anpassung hindeuten könnte. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass diese Studie einen umfassenden Einblick in die Zinkmangelanpassung von Arabidopsis thaliana liefert. Dabei konnten neue Erkenntnisse über die komplexe Beziehung zwischen DNA Methylierung und Genexpression gewonnen werden, über das Blühzeit-beeinflusste vegetative Wachstum und über die natürliche Variation des Mikronährstoffhaushalts im Samen. Diese aus Arabidopsis stammenden Ergebnisse könnten auf Kulturpflanzen übertragbar sein und damit hilfreich für die Züchtung von Kulturpflanzen.