Developing indicators and characterizing direct and residual effects of biological nitrification inhibition (BNI) by the tropical forage grass Brachiaria humidicola

Nitrogen (N) losses from agroecosystems harm the environment via increased nitrate (NO3-) amounts in water-bodies and nitrous oxide (N2O) emissions to the atmosphere. Bacteria and archaea oxidize ammonium (NH4+) to NO3- under aerobic conditions. Furthermore, under mainly anaerobic conditions, microbial denitrification reduces NO3- to gaseous N forms. The tropical forage grass Brachiaria humidicola (Rendle) Schweick (Bh) has been shown to reduce soil microbial nitrification via root derived substances. Therefore, biological nitrification inhibition (BNI) by Bh might contribute to reduction of N losses from agroecosystems. The present doctoral thesis aimed at assessing the potential of the actual BNI by Bh, as well as the residual BNI effect with new developed methodologies. The overall research was based on the following major objectives: (1) characterization of the residual BNI effect by Bh on recovery of N by subsequent cropped maize (Zea mays L.) under different N fertilization rates; (2) investigate if low enzymatic nitrate reductase activity (NRA) in leaves of Bh is linked to reduced NO3- nutrition by effective BNI; (3) identify a possible link between plant delta 15N of Bh and the BNI effect of different Bh genotypes on nitrification, plant N uptake and NO3- leaching losses. The overall objective was to use and test new methodologies with a minimum of disturbance of the plant-soil system, to characterize BNI of different Bh genotypes in greenhouse and field studies. The first research study focused on the investigation of a potential residual BNI effect of a converted long-term Bh pasture on subsequent maize cropping, where a long-term maize monocrop field served as control. The residual BNI effect was characterized in terms of enhanced maize grain yield, total N uptake and 15N (labeled) fertilizer recovery. Furthermore, the impact of residual BNI effect on soil N dynamics was investigated. The residual BNI effect was confirmed for the first maize crop season after pasture conversion on the basis of lower nitrification in incubation soil, higher total N uptake and higher maize grain yields. However, the residual BNI effect did not result in higher 15N fertilizer uptake or reduced 15N fertilizer losses, nor in reduced N20 emissions. Applied N was strongly immobilized due to long-term root turnover effects, while a significant residual BNI effect from Bh prevented re-mineralized N from rapid nitrification resulting in improved maize performance. A significant residual Bh BNI effect was evident for less than one year only. In the second research study it was the aim to verify the potential of nitrate reductase activity (NRA) as a proxy for the detection of in vivo performance of BNI by selected Bh accessions and genotypes grown under contrasting fertilization regimes. NRA was detected in Bh leaves rather than in roots, regardless of NO3- availability. Leaf NRA correlated with NO3- contents in soils and stem sap of contrasting Bh genotypes substantiating its use as a proxy of in vivo performance of BNI. The leaf NRA assay facilitated a rapid screening of contrasting Bh genotypes for their differences in in vivo performance of BNI under field and greenhouse conditions; but inconsistency of the BNI potential by selected Bh genotypes was observed. The third research study emphasized to link the natural abundance of delta 15N in Bh plants with reduced NO3- losses and enhanced N uptake due to BNI. Increased leached NO3- was positively correlated to rising delta 15N in Bh grass, whereas the correlation between plant N uptake and plant delta 15N was inverse. Long-term field cultivation of Bh decreased nitrification in incubated soil, whereas delta 15N of Bh declined and plant N% rose over time. Delta 15N of Bh correlated positively with assessed nitrification rates in incubated soil. It was concluded that decreasing delta 15N of Bh over time reflects the long-term effect of BNI linked to lower NO3- formation and reduced NO3- leaching, and that generally higher BNI activity of Bh is indicated by lower delta 15N plant values. Within the framework of this thesis, a residual BNI effect by Bh on maize cropping could be confirmed for one season due to the combined methodological approaches of soil incubation and 15N recovery. The development of the NRA assay for sampled Bh leaves was validated as a rapid and reliable method linked to the actual soil nitrification after NH4+ fertilizer supply. Consequently, the assay could be used for both greenhouse and field studies as BNI proxy. The gathered data from the third study indicated that decreasing delta 15N of Bh over time reflects the long-term effect of BNI linked to lower NO3- formation and reduced NO3- leaching, and that generally higher BNI activity of Bh is indicated by lower delta 15N plant values. Consequently, it was suggested that delta 15N of Bh could serve as an indicator of cumulative NO3- losses. Overall, this doctoral thesis suggests the depressing effect on nitrification by Bh might be a combined effect by BNI and fostered N immobilization. Furthermore, BNI by Bh might be altered by different factors such as soil type, plant age and root morphology of the genotypes. Finally, future studies should consider that Bh genotypes express their respective BNI potential differently under contrasting conditions.

Stickstoff(N)-Verluste von Agrarökosystemen schädigen die Umwelt einerseits durch erhöhte Nitratauswaschung (NO3-), und andererseits durch Emissionen von Lachgas (N2O) in die Atmosphäre. NO3- ist das Produkt des bodenmetabolischen mikrobiellen Prozesses der Nitrifikation. Bakterien und Archaeen oxidieren Ammonium (NH4 +) unter aeroben Bedingungen zu NO3-. Das tropische Futtergras Brachiaria humidicola (Rendle) Schweick (Bh) reduziert nachweislich die mikrobielle Nitrifikation im Boden durch Abgabe von Wurzelexsudaten. Daher könnte die biologische Nitrifikationshemmung (BNI) durch Bh zur Verringerung von N-Verlusten aus Agrarökosystemen beitragen. Von genotypischen Unterschieden innerhalb von Bh in Bezug auf BNI wurde berichtet. Die Entwicklung neuer BNI-Indikatoren für den Einsatz unter Feldbedingungen könnte dazu beitragen, die Diskrepanz zwischen den unter kontrollierten Bedingungen bestimmten BNI-Potentialen und der BNI-Exprimierung im Feld zu verstehen. Die Hypothese, BNI könnte die nitrifikationsbasierte NO3- Bildung reduzieren, und folglich die Verluste durch NO3-Auswaschung verringern, wurde jedoch noch nicht überprüft. Die vorliegende Doktorarbeit basierte auf den folgenden Hauptzielen: (1) Der Charakterisierung des verbleibenden BNI-Effekts durch Bh auf die N-Aufnahme durch nachfolgenden Maisanbau (Zea mays L.) unter verschiedenen N-Düngungsraten; (2) Der Untersuchung, ob eine niedrige enzymatische Nitratreduktase-Aktivität (NRA) in den Blättern von Bh mit einer verringerten NO3- Ernährung durch einen effektiven BNI-Effekt verbunden ist; (3) Der Identifikation einer möglichen Verbindung zwischen der δ15N Pflanzensignatur von Bh Hybriden und deren BNI-Wirkung auf Nitrifikation, Pflanzen-N-Aufnahme und NO3-Auswaschungsverluste. Das übergeordnete Ziel bestand darin, neue Methoden mit einer minimalen Störung des Pflanzen-Boden-Systems zu verwenden und zu testen, um den BNI-Effekt verschiedener Bh-Genotypen in Gewächshaus- und Feldstudien zu charakterisieren. Die erste empirische Studie konzentrierte sich auf die Untersuchung eines möglichen Folgeeffekts durch BNI einer umgebrochenen Langzeit-BH-Weide auf anschließenden Maisanbau. Der BNI-Folgeeffekt wurde im Hinblick auf erhöhte Maisertragsausbeute, Gesamt-N-Aufnahme und 15N-Düngemittelrückgewinnung charakterisiert. Darüber hinaus wurde der Einfluß des verbleibenden BNI-Effekts auf die N-Dynamik untersucht. Der verbleidende BNI-Effekt wurde für die erste Maiserntezeit nach Bh-Weideumbruch auf der Basis von geringerer Nitrifikation in Inkubationsstudien, höherer Gesamt-N-Aufnahme und höheren Maiserträgen bestätigt. Der BNI-Folgeeffekt führte jedoch weder zu einer höheren 15N-Düngeraufnahme oder reduzierten 15N-Düngerverlusten. Ein signifikanter BNI-Folgeeffekt war jedoch nur für weniger als ein Jahr nachweisbar. In der zweiten Forschungsstudie wurde das Ziel verfolgt, das Potential der Nitratreduktaseaktivität (NRA) als Indikator für den aktuellen BNI-Effekt ausgewählter Bh-Akzessionen und Genotypen, die unter kontrastierenden Düngungsregimen getestet wurden, zu verifizieren. NRA wurde in Bh-Blättern, jedoch nicht in Wurzeln nachgewiesen, unabhängig von der NO3- Verfügbarkeit. Der Blatt-NRA-Test erleichterte ein schnelles Screening von kontrastierenden Bh-Genotypen in Bezug auf Unterschiede des in-vivo BNI-Effekts unter Feld- und Gewächshausbedingungen. Es wurde jedoch eine Inkonsistenz des BNI-Potentials innerhalb der ausgewählten Bh-Genotypen beobachtet. Die dritte Forschungsstudie untersuchte, ob die natürliche Abundanz von 15N (δ) in Bh-Pflanzen mit reduzierten NO3- Verlusten und einer verstärkten N-Aufnahme durch BNI verknüpft werden kann. Erhöhte NO3- Auswaschung war positiv mit steigendem δ15N in Bh korreliert, während die Korrelation zwischen Pflanzen-N-Aufnahme und δ15N in der Pflanze negativ war. δ15N-Werte in Bh korrelierten positiv mit Nitrifikationsraten in inkubierten Bodenproben. Schlußendlich konnte angenommen werden, dass die δ15N-Abnahme über die Zeit in Bh den BNI-Langzeiteffekt in Verbindung mit geringerer NO3- Bildung und reduzierter NO3- Auswaschung widerspiegelt, und dass eine allgemein höhere BNI-Aktivität von Bh durch niedrigere δ15N-Pflanzenwerte angezeigt wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte ein verbleibender BNI-Effekt durch Bh auf darauffolgenden Maisanbau aufgrund der kombinierten methodischen Ansätze der Bodeninkubation und der 15N-Rückgewinnung für eine Saison bestätigt werden. Zudem wurde die NRA-Blatt-Methode entwickelt, welche eine schnelle und zuverlässige Analysemethode für die tatsächliche Bodennitrifikation nach NH4+-Düngung darstellt. Folglich könnte der Test sowohl für Gewächshaus- als auch für Feldstudien als BNI-Proxy verwendet werden. Die gesammelten Daten aus der dritten Studie zeigen, dass eine Abnahme von δ15N-Werten in Bh über die Zeit den BNI-Langzeiteffekt in Verbindung mit geringerer NO3- Bildung und reduzierter NO3- Auswaschung widerspiegelt. Zudem wird eine allgemein höhere BNI-Aktivität von Bh durch niedrigere δ15N-Pflanzenwerte angezeigt. Daraus läßt sich folgern, dass δ15N von Bh als Indikator für kumulative NO3- Verluste dienen kann. Insgesamt legt diese Dissertation nahe, dass die hemmende Wirkung auf die Nitrifikation durch Bh ein kombinierter Effekt von BNI und einer verstärkte N-Immobilisierung sein könnte. Darüber hinaus könnte der BNI-Effekt von Bh durch verschiedene Faktoren wie Bodenart, Pflanzenalter und Wurzelmorphologie der Genotypen variieren. Ebenfalls sollten zukünftige Studien berücksichtigen, dass Bh-Genotypen ihr jeweiliges BNI-Potential unter gegensätzlichen Bedingungen unterschiedlich exprimieren.