Diurnal and photoperiodic effects on the immune system and glucocorticoid signaling in domestic pigs

Physiology and behavior of humans and animals display pronounced diurnal and seasonal rhythmic variations. Diurnal rhythms are controlled by daylight and seasonal rhythms are adjusted by the photoperiod, i.e., the relative span of light per day. Modern human life and housing conditions of livestock are often directed against natural daylight conditions and thus, may entail circadian disruption causing misalignment between the central circadian pacemaker and peripheral tissues. Thereby, glucocorticoids are regarded as a main link between these compartments. Circadian disruption might be detrimental for health, in particular affecting immune function, which was mainly investigated in humans and nocturnal rodents but underlying mechanisms are not clearly defined yet. Therefore, the main objective of the present thesis was to investigate diurnal and photoperiodic effects on the immune system and glucocorticoid signaling as well as potential underlying endocrine, behavioral, and molecular mechanisms of these effects in domestic pigs. Adult male castrated pigs, held under specific lighting schedules, were surgically catheterized to enable blood collection without disturbance of the animals. Initially, domestic pigs were held under standard 12L:12D-lighting conditions and blood samples were taken every 2 hours over periods of up to 50 hours. Cosinor analyses revealed pronounced diurnal rhythmicity in peripheral leukocyte numbers of various immune cell populations. These rhythms were mainly comparable to results in humans and nocturnal rodents in relation to their respective rest-activity cycles, with the exception of porcine neutrophils differing from both species. Moreover, the investigated diurnal rhythms in activity behavior and plasma cortisol concentration confirmed that domestic pigs under the applied experimental conditions are diurnally active like humans. Linear mixed model analyses revealed associations of immune cell counts with plasma cortisol concentration, which also resembles results from humans and rodents. Subsequently, photoperiodic effects on diurnal rhythms in peripheral immune cell numbers were investigated for the first time in any species. Domestic pigs were held either under long day conditions (LD) or under short day conditions (SD) and were sampled every 2 hours over periods of 50 hours. Distinct photoperiodic differences in relative amplitudes and peak times of cell counts in various porcine leukocyte types were found, whereas mesor values did not differ. Moreover, photoperiodic effects on diurnal rhythms in plasma cortisol concentrations and activity behavior were found, which is in agreement with human and primate studies. Generalized linear mixed model analyses again revealed associations of leukocyte counts with plasma cortisol concentration and with activity behavior as well. In summary, the results imply stronger rhythmicity of peripheral immune cell numbers in general under SD than under LD. Common intrinsic mechanisms seem to regulate diurnal rhythms in peripheral leukocyte numbers in most immune cell types in domestic pigs, except for neutrophils again. Finally, to investigate potential molecular differences in diurnal regulation between different immune cell types, glucocorticoid receptor (GR) number and affinity were examined in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and granulocytes of domestic pigs. Thereby, a greater number of GR sites per cell and a higher GR binding affinity in PBMC compared to granulocytes were found, pointing to differences in the molecular mechanisms of glucocorticoid signaling between leukocyte populations. The results of the present thesis project are subsequently discussed in regard to specific implications for immune function and health as well as animal husbandry and welfare. Moreover, a methodological assessment of the approaches used within the thesis project was carried out and finally, suggestions for future research directions were given. In conclusion, the present thesis revealed for the first time diurnal and photoperiodic effects on the immune system as well as glucocorticoid signaling in domestic pigs and uncovered potential underlying mechanisms of these effects. Hence, an additional diurnally active model species in chronoimmunology research was established. Moreover, conducting chronoimmunology research in the porcine species represents an innovative approach in agricultural science and provides entirely new opportunities to improve animal health and welfare. Thereby, future studies might investigate diurnal differences in immune function, clarify the role of different zeitgebers on immune rhythms, and assess potential consequences of stressor exposure at different times of the day.

Physiologie und Verhalten von Menschen und Tieren unterliegen deutlich ausgeprägten diurnalen und saisonalen Schwankungen. Dabei werden diurnale Rhythmen über das Tageslicht und saisonale Rhythmen über die Photoperiode, also die Tageslänge, gesteuert. Unser modernes Leben und die Haltungsumwelt von Nutztieren stehen oft nicht im Einklang mit natürlichen Lichtbedingungen. Dadurch kann eine Entkopplung zwischen der sog. Inneren Uhr im Gehirn und peripheren Uhren in anderen Geweben entstehen. Glucocorticoide spielen dabei als Bindeglied eine wichtige Rolle. Diese Desynchronisation kann sich negativ auf die Gesundheit auswirken, besonders auf die Immunfunktion. Dies wurde bisher jedoch nur beim Menschen und bei nachtaktiven Nagern untersucht und mögliche Zusammenhänge sind bis jetzt nur unzureichend aufgeklärt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, diurnale und photoperiodische Einflüsse auf das Immunsystem und auf Glucocorticoide sowie zugrundeliegende endokrine, verhaltensbasierte und molekulare Wirkungsmechanismen beim Schwein zu untersuchen. Dafür wurden adulte Kastraten unter spezifischen Lichtbedingungen gehalten und die Blutprobenahme erfolgte über venöse Dauerkatheter, um die Tiere nicht zu stören. Zunächst wurden Schweine unter standardisierten 12L:12D-Lichtbedingungen gehalten und alle 2 Std. über einen Zeitraum von bis zu 50 Std. Blutproben entnommen. Dabei wurden deutlich ausgeprägte diurnale Rhythmen in der Zellzahl verschiedener Leukozyten-Subpopulationen im peripheren Blut mittels Cosinoranalyse charakterisiert. Die Rhythmen waren zumeist vergleichbar mit Ergebnissen bei Menschen und Nagern im Verhältnis zum Aktivitätsrhythmus der jeweiligen Spezies. Eine Ausnahme stellten jedoch die neutrophilen Granulozyten dar, denn ihr Rhythmus war mit keiner der beiden genannten Spezies vergleichbar. Des Weiteren wurde durch die Untersuchung diurnaler Rhythmen im Aktivitätsverhalten und der Plasma-Cortisolkonzentration bestätigt, dass Schweine unter diesen experimentellen Bedingungen tagaktiv sind, also vergleichbar zum Menschen. Statistische Analysen zeigten Zusammenhänge zwischen der Immunzellzahl im Blut und der Plasma-Cortisolkonzentration. Dies bestätigt Ergebnisse von Menschen und Nagern. Anschließend wurden – als weltweit erste Untersuchung überhaupt – photoperiodische Effekte auf diurnale Rhythmen in der Immunzellzahl im peripheren Blut untersucht. Dazu wurden Schweine entweder unter Langtag- (LD) oder Kurztagbedingungen (SD) gehalten und alle 2 Std. über eine Dauer von 50 Std. beprobt. Dabei wurden bei verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen deutliche Unterschiede in der relativen Amplitude und der Acrophase der Zellzahlen im peripheren Blut gefunden. Die Mesor-Werte unterschieden sich jedoch nicht. Des Weiteren wurden auch photoperiodische Effekte auf diurnale Rhythmen in der Plasma-Cortisolkonzentration und dem relativen Aktivitätsverhalten gezeigt, was mit bisherigen Studien bei Menschen und Primaten übereinstimmt. Statistische Analysen zeigten auch hier Zusammenhänge zwischen der Immunzellzahl im Blut und der Plasma-Cortisolkonzentration sowie dem Aktivitätsverhalten. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse eine generell stärker ausgeprägte Oszillation der Immunzellzahlen im Blut unter SD als unter LD an. Ferner scheinen die diurnalen Rhythmen der Immunzellzahl im Blut bei den meisten porcinen Immunzelltypen über gemeinsame intrinsische Mechanismen reguliert zu werden, wobei die neutrophilen Granulozyten wiederum eine Ausnahme bilden. Schließlich wurden zur Aufklärung möglicher molekularer Unterschiede in der diurnalen Regulation von Immunzellen, Anzahl und Affinität von Glucorticoidrezeptoren (GR) in peripheren mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) und Granulozyten beim Schwein untersucht. Dabei wurde eine größere Anzahl und eine höhere Affinität der GR in PBMC im Vergleich zu Granulozyten festgestellt. Dies lässt auf Unterschiede in den molekularen Wirkungsmechanismen von Glucocorticoiden bei verschiedenen Leukozyten-Subpopulationen schließen. Zusammenfassend werden die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit im Hinblick auf ihre Bedeutung für die Immunfunktion und Gesundheit als auch für die Tierhaltung und das Wohlergehen der Tiere diskutiert. Zusätzlich wird die Arbeit umfassend methodologisch bewertet und es werden weiterführende Forschungsmöglichkeiten eröffnet. In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals diurnale und photoperiodische Einflüsse auf das Immunsystem sowie auf Glucocorticoide beim Schwein gezeigt und mögliche zugrundeliegende Wirkungsmechanismen charakterisiert. Damit wurde das Schwein als tagaktive Modellspezies in der chronoimmunologischen Forschung eingeführt. Darüber hinaus stellt diese Arbeit einen innovativen Ansatz in den Agrarwissenschaften dar und bietet somit ganz neue Möglichkeiten, um Gesundheit und Wohlergehen bei Nutztieren zu fördern. Zukünftige Studien könnten diurnale Unterschiede in der Immunfunktion untersuchen, die Rolle verschiedener Zeitgeber-Mechanismen im Immunsystem aufklären und mögliche Konsequenzen einer Stressoren-Einwirkung zu unterschiedlichen Tageszeiten erforschen.