Marker Assisted Selection for the development of intervarietal substitution lines in rapeseed <i>(Brassica napus L.)</i> and the estimation of QTL effects for glucosinolate content | Markergestützte Selektion für die Entwicklung von intervarietalen Substitutionslinien bei Raps <i>(Brassica napus L.)</i> und die Schätzung von QTL-Effekten für Glucosinolatgehalt. | Seleção assistida por marcadores para o desenvolvimento de linhas de substituição invervarietais em colza <i>(Brassica napus L.)</i> e estimativa do efeito dos QTL para teor de glucosinolatos

Raps (Brassica napus L.) ist eine der wichtigsten Ölpflanzen der Welt. In 2002 lag der Anteil von Raps an der weltweiten Anbaufläche für Ölpflanzen bei 10,13%, und die Produktion betrug 36.371.000 t. Ein besseres Wissen über die Genetik und Vererbung von Merkmalen bei Raps ist deshalb von großer Bedeutung. Nachdem das Öl extrahiert ist, dient das verbleibende Schrot als hochwertige Proteinquelle für die Tierernährung. Da aber einige Komponenten im Mehl schädliche Wirkung haben, wie die Glucosinolate, bleibt es immer noch ein Ziel der Züchtung Sorten zu entwickeln die einen geringeren Anteil an Glucosinolaten haben.Sechs QTL für Glucosinolatgehalt wurden bisher identifiziert in einer Kreuzung zwischen Mansholt' und Samourai'. Drei davon zeigen größere Effekte (major QTL) und drei nur kleine Effekte (minor QTL). In modernen Züchtungsprogrammen kommt es immer wieder vor, dass aus Kreuzungen zwischen Eltern die beide einen niedrigen Glucosinolatgehalt haben, Nachkommen entstehen, die einen höheren Gehalt als die Eltern haben. Deshalb ist ein besseres Verstehen der Vererbung dieses Merkmals erwünscht.In diesem Sinne wurde im Rahmen dieser Studie versucht, mehr über dieses Merkmal zu erfahren, in dem man zwei Ziele verfolgte. Das erste Ziel war die Erstellung eines Basismaterials für die Herstellung von Substitutionslinien ( Invervarietal Substitution Lines"). Das zweite Ziel war die Schätzung der Effekte der sechs genannten QTL durch Feldversuche mit spaltenden BC3 Familien.Für das erste Ziel sollten über markergestützte Rückkreuzungen mit Hilfe von AFLP-Markern eine Serie sog. intervarietal substitution lines" hergestellt werden. Diese Substitutionslinien enthalten vor dem gemeinsamen Hintergrund des rekurrenten Elters jeweils ein einzelnes genau definiertes Segment des Donorgenoms. In einer Serie decken diese Segmente, z. T. überlappend, das gesamte Genom des Donorelters ab. Serien solcher Substitutionslinien repräsentieren daher ein genetisch sehr gut charakterisiertes Material, das ideal geeignet ist für eine genomweite Charakterisierung alleler Variation sowohl auf phänotypischer als auch auf molekularer Ebene. Die Arbeit begann mit einer Population von doppelt haploid Linien (DH Linien) hergestellt aus einer Kreuzung zwischen zwei Winterrapssorten, ´Mansholt's Hamburger Raps´ und ´Samourai´. Zehn dieser DH Linien mit Donorsegmente die das gesamte Genom abdecken, wurden durch markergestützte Selektion ausgewählt. Diese zehn Linien wurden mit Samourai rückgekreuzt um zehn BC1 Genotypen zu erzeugen, die dann ein zweites Mal mit Samourai rückgekreuzt wurden, so dass eine BC2 Population mit 300 Pflanzen entstand. Diese wurde dann mit 140 AFLP Markern (114 loci) untersucht und 20 Pflanzen konnten selektiert werden deren Donorsegmente wiederum das gesamte Donorgenom abdeckten. Da eine bessere Abdeckung des Genoms erwünscht war, wurden in den 20 selektierten Pflanzen noch einige AFLP Primerkombinationen eingesetzt, sowie zwei Mikrosatelliten-Markern und ein RAPD-Marker, wodurch sich eine Gesamtzahl von 164 Markers (130 loci) ergab, die etwa 1325 cM des Rapsgenoms abdecken.Die 20 selektierten BC2 Genotypen wurden abermals mit Samourai rückgekreuzt um eine Population von 300 BC3 Pflanzen zu erzeugen. Diese wurde dann mit 132 Markern (120 loci) analysiert. Insgesamt 52 BC3 Pflanzen wurden selektiert deren Donorsegmente des Mansholt Genom wiederum abdecken. Allerdings wurde unter den 300 BC3 Genotypen keiner gefunden der nur noch ein Donorsegment enthält, sondern die verschiedene BC3 Pflanzen enthielten zwischen 2 und 13 Donorsegmente. Das Ergebnis war nach vorliegenden Studien unerwartet. In diesen Studien waren in der BC3 schon Genotypen aufgetreten, die nur ein Donorsegment enthielten. Aber eine genauere Betrachtung dieser Untersuchungen zeigte dass bei der Selektion nicht das gesamte kartierte Genom berücksichtig worden war, also mit den hergestellten Substitution Linien wurde nicht das gesamte kartierte Donorgenom abgedeckt. In der vorliegenden Studie wurde dagegen immer das ganze kartierte Genom betrachtet sofern die Markerabdeckung es ermöglichte.Was es dem zweiten Ziel angeht, die Rückkreuzungspopulationen die herstellt wurden für die Entwicklung des Substitutionslinien, wurden auch für die Schätzung der Effekte der sechs QTL für Glucosinolatgehalt benutzt. Die Nachkommenschaften der mit Markern analysierten BC2 Pflanzen wurden in zwei Feldversuchen in Göttingen getestet. 279 BC3 Familien, die 10 selektierten DH Linien und die entsprechenden BC1 Genotypen sowie die Eltern der Kreuzung wurden im Jahr 2001/2002 in Parzellen mit je 50 Pflanzen angebaut. Der Glucosinolatgehalt in den Körnern wurde in ganzen Korn durch NIRS (near infrared reflectance spectroscopy) gemessen. Von den angebauten Familien wurden, nach Abschluss der Markerselektion, nur die Familien ausgewählt, die für einen oder zwei QTL segregierten. Von diesen Familien wurden dann einzeln Pflanzen geerntet und mit NIRS gemessen um innerhalb der Familien die Spaltung erkennen zu können. Der QTL Effekt bei den BC3 Familien, die für nur einen QTL segregierten, wurde aus der Differenz zwischen den phänotypischen Klassen, die sich durch die Segregation ergaben, bestimmt.Für die zwei major QTL auf den Kopplungsgruppen 16 und 18 wurde eine klare 1:1 Spaltung erkennbar, was allerdings nicht bei der Kopplungsgruppe 9, oder bei den minor QTL der Fall war. In Familien wo die phänotypischen Klassen nicht klar zu erkennen waren wurde der QTL Effekt geschätzt mittels eines Vergleichs zwischen dem phänotypischen Mittelwert (z) der BC3 Familie und dem phänotypischen Mittelwert (y) des rekurrenter Elters (Samourai) unter der Annahme das "z" durch folgende Formel errechnet werden kann: "z = (x + y)/2". Hier steht "x" für den der phänotypischen Wert der heterozygoten Klasse und "y" für den homozygoten Klasse, die Samourai entspricht. Der phänotypische Wert der heterozygoten Klasse der spaltenden BC3 Familien (die für nur einen QTL spalten) kann dann nach Umformung als "x = (2z) - y" errechnet werden, und der QTL Effekt als die Differenz zu Samourai, also als "x-y".Die Effekte der 2 major QTL (auf Kopplungsgruppen 16 und 18), aber auch der dritte QTL (Kopplungsgruppen 9), sind so deutlich, dass dessen genaue Lokalisierung (aus früheren Studien durch composite interval mapping') bestätigt werden konnte. In den BC3 Familien ist der QTL Effekt die Summe von Additiv- und Dominanzeffekt, wobei epistatische Effekte nicht ausgeschlossen sind. Wenn man diese QTL Effekte mit den durch Intervall Kartierung geschätzten Werten vergleicht, erkennt man dass deutliche Dominanzeffekte vorhanden sind. Für den QTL auf Kopplungsgruppe 18 sind Additiv- und Dominanzeffekte etwa gleich groß. Bei den anderen zwei QTL sind die Dominanzeffekte größer als die Additiveffekte. Für die 3 minor QTL konnten Effekte gefunden werden aber nur der Effekt auf Kopplungsgruppe 3 war statistisch signifikant. Epistatische Effekte konnten ebenfalls nachgewiesen werden, und zwar in den BC3 Familien die für 2 QTL spalten.

Rapeseed (Brassica napus L.) is one of the most important oil crops of the world and in 2002 represents 10.1% (26 million ha) of the harvested area from oilseed crops, producing 31,604,000 t seeds. A better understanding of the genetics and inheritance of characters in rapeseed is therefore an important objective of plant breeding research. After extraction of the oil, which is the most valuable seed component, the resulting meal is an important protein source for animal feed. Since some components present in the meal are detrimental to animal nutrition, like glucosinolates, it still remains a breeding aim to have varieties with lower glucosinolate content.Six QTL for glucosinolate content have been identified until now in rapeseed in the cross Mansholt x Samourai. Three of them have been reported to have an important effect (major QTL) while the other three showed only smaller effects (minor QTL). Despite the use of low glucosinolate genotypes in modern breeding programmes it seems to be common that genotypes appear, through segregation, which carry higher levels of glucosinolates than each of the parents.Trying to improve information which respects to the glucosinolate content in rapeseed the specific aims of the present work consists of two points. The first objective was the production of basic material for the development of intervarietal substitution lines. The second objective was to investigate the inheritance of glucosinolate content, i.e., the estimation of the effect of the alleles of six QTL based on field trials in which BC3 families segregating for one or two of the QTL were tested.With reference to the first aim mentioned, using marker assisted backcrossing a set of intervarietal substitution lines should be developed. Sets of such intervarietal substitution lines represent a genetically well characterised material that is ideally suited for a genome wide analysis of the effects of allelic variation on the phenotypic and molecular levels. Within the common genetic background of the recurrent parent, each line will contain a small, well-defined segment of the genome of the donor parent. Across all lines of a series, these segments will, partially overlapping, represent the entire donor genome. The work began with a double haploid (DH) population developed from a cross between doubled haploid lines of the two winter rapeseed varieties 'Mansholt's Hamburger Raps' and 'Samourai'. In the development of the substitution lines 'Mansholt', an old Dutch variety, was used as donor parent and 'Samourai', a current French variety, as recurrent parent. Ten DH lines carrying donor segments covering the whole donor genome were selected through marker assisted selection. These ten DH lines were crossed with Samourai resulting in ten BC1 genotypes which were again backcrossed with Samourai producing a BC2 population with 300 plants. These plants were analysed with 140 AFLP markers (114 loci) and 20 out of 300 could be selected which donor segments cover the entire donor genome. Because a better coverage of the genome was desired the 20 selected plants were analysed with more AFLP markers as well as with two SSR and one RAPD markers, giving a total of 164 markers (130 loci) which cover 1,325 cM of the rapeseed genome. The 20 selected BC2 genotypes were also backcrossed to Samourai and a population of 300 BC3 plants was obtained. These plants were analysed by 132 markers (120 loci) and 52 plants were selected which donor segments cover the mapped Mansholt's genome. However among these 300 plants none could be found having only one donor segment. The number of donor segments in the BC3 plants ranged from 2 to 13. This was, according to literature information, not expected. Previous studies could find already in BC3 populations genotypes carrying only one donor segment. But looking into these studies more carefully it became clear that this was only possible through the fact that not the whole mapped donor genome was covered. In the present study, the whole mapped genome was covered.Concerning to the second objective of this study, the backcross populations used for the development of the substitution lines were also used for the estimation of QTL effects of the six QTL for glucosinolate content. The offspring of the BC2 population analysed by markers were evaluated in two field trials in Göttingen. 279 BC3 families, the 10 DH lines initially selected for the development of the intervarietal substitution lines and their derived BC1 genotypes as well as the parental lines (Samourai and Mansholt), were grown in 2001/2002 in field trials at two locations in plots with 50 plants. Seed glucosinolate content was determined in intact-seed samples by near infrared reflectance spectroscopy (NIRS). Based on the marker information on BC2, BC3 families segregating for only one or two of the six QTL were selected and seed glucosinolate content was determined from individual plants. From such families the plants were individually harvested and analysed by NIRS, to look after the segregation within each family. QTL effects in BC3 families segregating for only one of the QTL were calculated as the difference between phenotypic classes.For the two major QTL on linkage groups 16 and 18 clear 1 : 1 segregations into two phenotypic classes were observed, which was not the case for the major QTL on linkage group 9 and for the three minor QTL, and therefore another strategy was necessary to estimate the QTL effects in these cases. In families were phenotypic classes could not be clearly distinguished the QTL effect was calculated by comparing the phenotypic mean (z) of the BC3 family with the phenotypic mean (y) of the recurrent parent Samourai under the assumption that "z" can be calculated as "z =(x + y)/2" with "x" being the phenotypic mean of the heterozygous class and "y" of the homozygous class, which corresponds to Samourai. In this way, in BC3 families segregating for only one QTL the phenotypic mean of the heterozygous class can be calculated as "x = (2z) - y", and the QTL effect as "x-y".In this study the positions of the 3 major QTL could be confirmed, since in the expected regions in which they had been mapped in previous studies (by composite interval mapping), clear effects on glucosinolate content in the BC3 families were observed. In the BC3 families the QTL effect estimated is the sum of additive effects and dominance effects, and even epistatic effects are not excluded. A comparison with the additive effects estimated by composite interval mapping indicates the presence of strong dominance effects. For the QTL on linkage group 18 additive and dominance effects are nearly equal. For the other two major QTL the dominance effects are larger than the additive effects. With respect to the 3 minor QTL, some effects could be found for each of them, although only the effect of the QTL on LG 3 was statistically significant. The results show also that some other factors are guiding this trait, like epistasis, so that the complete elucidation of the genetic con! trol of glucosinolates in rapeseed still needs more time and investigation. Epistatic effects could also be found in BC3 families segregating for 2 QTL.