Actions of lignocellulolytic enzymes on Abies grandis(grand fir) wood for application in biofuel production

Abies grandis ist ein schnell wachsender Nadelbaum, der großes Potential in der nachhaltigen Holzproduktion und deren verarbeitetenden Industrie besitzt. Daher ist es für mögliche Anwendungen notwendig, mehr über das Verhalten von A. grandis Holz gegenüber holzabbauenden Pilzen zu erfahren. In Abbauversuchen nach Norm EN 113 (1996) konnten sowohl Holz als auch Holzprodukte von A. grandis durch Braunfäulepilze abgebaut werden, aber gegenüber Weißfäulepilzen zeigten A. grandis Holz eine vergleichsweise gute Resistenz. Früh- und Spätholz von A. grandis wurde in unterschiedlicher Stärke über die Inkubationszeit abgebaut. Nach 19 Wochen zeigten die vom Braunfäulepilz Corniophora puteana besiedelten Früh- und Spätholzproben einen höheren Gewichtsverlust als die Frühholzproben. Im Gegensatz dazu verursachte der Weißfäulepilz Trametes versicolor einen 2mal höheren Gewichtsverlust bei Frühholzproben im Vergleich zu Früh- und Spätholzproben. Behandlung mit Harnstoffformaldehyd oder Ammoniumsulfat steigerte die Beständigkeit des Holzes gegenüber Weißfäulepilzen. Wasser- und Aceton-extrahiertes Holz verlor dagegen an Resistenz- rissiges Holz war darüber hinaus auch anfälliger; wahrscheinlich erlauben Risse Pilzen einen leichten Eintritt ins Holz. Es wurde angenommen, dass Weißfäulepilze oxidative Enzyme (Laccasen, Peroxidasen) sekretieren, um das in den Holzzellwänden vorkommende Lignin zu modifizieren. Diese Modifikation des Lignins resultiert in Chinonstrukturen, die mit MBTH (3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon Hydrochlorid Monohydrat) gefärbt werden kön-nen, worauf eine rötliche Farbe entsteht. Die Effekte der oxidativen Enzyme auf Holzzellwände wurde untersucht, in dem Holzschnitte mit MBTH inkubiert wurden. Rötliche Färbung der Holzzellwand deutete dabei auf modifiziertes Lignin in der Holzzellwand hin. Die Dicke der Zellwand und deren Färbung verringerten sich durch längere Inkubation mit T. versicolor, wahrscheinlich durch starken Ligninabbau. Inner-halb von Jahrringen nahm der Anteil des gefärbten Zellwandbereichs (AS) und der gesamte Zellwandbereich (AT) in einer s-förmigen Kurvenform vom Früh- zum Spätholz zu. Um den Angriff der Pilze auf das Lignin zu simulieren, wurde das RedOx-Enzym Laccase mit Mediator (HBT: 1-Hydroxybenzotriazol, HBA: 4 Hydroxybenzoesäure; beide Substanzen reagieren nach Oxidation durch Laccase mit Lignin) oder Mn3+-Ace-tat als ein mit Lignin reagierendes Produkt der pilzlichen Manganperoxidase in A. grandis Vollholz injiziert. Die rötliche Färbung mit MBTH war etwas besser mit Laccase mit HBT als mit HBA. Auch die Inkubation mit Mn3+-Acetat ergab eine rötliche Färbung der Holzzellwände, wobei die stärkste Färbung bei der höheren Mn3+-Acetat Konzentration von 10 mM auftrat. Die Weißfäulepilze Pleurotus ostreatus und T. versicolor zählen zu den besten Laccaseproduzenten bei Zugabe von A. grandis Holz als Laccaseinduktor zu Pilzkultu-ren. Holz und Holzextrakstoffe induzierten in Abhängigkeit von Konzentration die Produktion von extrazellulären Laccasen, aber nicht von anderen lignozellulolytischen Pilzenzymen, wie Manganperoxidase (MnP), Ligninperoxidase (LiP) oder Zellulasen als Enzyme, die ebenfalls mit Lignocellulose reagieren. Aus Kultivierungsversuchen der Pilze in Medium mit Holz und unterschiedlichen C und N Gehalten läßt sich folgern, dass das C/N Verhältnis des Holzes ein weiterer genereller Faktor in der Laccase-induktion ist. Holzextraktstoffe von A. grandis zeigten inhibierende Wirkung auf das Wachs-tum der Weißfäulepilze Coprinopsis cinerea, P. ostreatus und T. versicolor. Die extra-hier¬baren Holzstoffe wurden mittels Gaschromatographie und Massenspektro¬metrie (GC-MS) identifiziert. In den Wasser- und den Acetonextrakten wurden neun verschie-de¬ne phenolische Stoffe gefunden: 2-Methoxyphenol (Guajacol), 4-Hydroxybenzaldehyd, 1,4-Dihydroxybenzen (Hydrochinon), 3,5-Di-tertbut-4-hydroxytoluol (Butylhydroxytoluol), 3-Methoxy-4-hydroxybenzaldehyd (Vanillin), 4-Hydroxybenzoesäure, 3-Methoxy-4-hydroxybenzoesäure (Vanillinsäure), 4-Hydroxy-zimtsäure (p-Cumarin-säure) und 4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure (Ferulasäure). Einige der natürlichen phe-nolischen Stoffe, wie 4-Hydroxyzimtsäure, 4-Hydroxybenzaldehyd oder 3,5-Di-tertbut-4-hydroxytoluol können als natürliche Induktoren in der Laccaseproduktion mit P. ostreatus und T. versicolor eingesetzt werden. Allerdings hemmte die Zugabe von 1,4-Dihydroxybenzen und p-Benzochinon zu den Flüssigkulturen in der Konzentration von 1 mM das Wachstum von P. ostreatus und T. versicolor. Durch Holyextrakstoffe in der Produktion induzierte Lasseisoenyzme der beiden Pilze wurden mittels nativer Gelelektrophorese analysiert und mittels MS-Analyse der proteolytisch verdauten Proteine indentifiziert. Im Fall von P. ostreatus wurde das Isoenzym Laccase II und im Fall von T. versicolor die Isoenzyme Laccase I und Laccase III gefunden. Weiterhin wurde A. grandis Holz für den technischen Einsatz in der enzymati-schen Biokraftstoffherstellung getestet. Dabei konzentrierten sich die Experimente auf chemische, physikalisch-chemische und biologische Vorbehandlungen des Holzes und auf die Hydrolyse von Zellulose durch Zellulasen, die entweder allein oder in Kombina-tion mit anderen Enzymen (Xylanase, Laccase oder β-Glukosidase) eingesetzt wurden, um eine hohe Ausbeute an Glukose aus dem lignozellulosehaltigen Substrat für die Bio-kraftstoffherstellung zu erhalten. In biologischen Vorbehandlungen wurden kleine A. grandis Holzblöcke für 19 Wochen nach der Norm EN 113 (1996) mit Pilzen inku-biert. Die biologische Vorbehandlung mit P. ostreatus (im Vergleich zu T. versicolor und C. puteana) ergab exzellente Raten von 42,8% für die Umsetzung der gesamten Holzmasse in Glukose, was 92,4% der im A. grandis Holz verfügbaren Zellulose entspricht. Eine energieaufwendigere Vorbehandlung unter Einsatz von 8 ml einer 85%igen Phosphorsäure für 1 h bei 50oC resultierte ebenfalls in guten Glukoseausbeuten bei An-wendung von jeweils 4 U ml-1 Zellulase, Xylanase und Laccase. Längere Inkubations-zeiten und höhere Konzentrationen und Mengen an Phosphorsäure bei einer Inkuba-tionstemperatur von 50oC führten zu Gewichtsverlusten von bis zu 50% bei gleichzei-tiger Steigerung des Zelluloseanteils auf bis zu 100%. Höchste Glukoseausbeuten (bis zu 100%) konnten durch eine physikalisch-chemische Vorbehandlung erzielt werden, bei der 1 g Holzpartikel in 8 ml einer 85%igen bzw. 80%igen Phosphorsäure für 20 sec in einer Mikrowelle erhitzt wurde, und eine anschließende Hydrolyse mit einer Mi-schung aus 4 U ml-1 Zellulase, 4 U ml-1 Xylanase und 4 U ml-1 Laccase oder, alternativ zur Laccase, 4 U ml-1 β-Glukosidase für 24 h in 5 ml 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5.0. Die Mikrowellenbehandlung erlaubte eine Reduzierung der Phosphoräurekon-zentration unter 80% bis hin zu 40% und 20% mit noch annehmbaren Zuckerausbeuten in nachfolgender enyzmatischer Hydrolose der Zellulose (60% Umwandlung von Zellulose in Glukose), aber nur, wenn Zellulase und Xylanase zusammen mit Laccase eingesetzt wurden. Wasserextrakte aus Holz, bzw. spezifische phenolische Substanzen (p-Cumarinsäure, Vanillinsäure und Ferulasäure) in den Extrakten, zeigten inhibierende Wirkung bei der Hydrolyse von Zellulose mit Zellulase. Phenolische Stoffe in den Holzextrakstoffen können durch Laccaseaktivität abgebaut werden, was einen höheren Umsatz der Zellulasen in der Glukoseproduktion gewährleistet und was den positiven Effekt der Laccase auf die Glukoseproduktion aus Zellulose von A. grandis Holz erklärt.

Abies grandis is a fast growing coniferous tree with a high potential for sustainable wood production and applications in the wood product industry. However, for the possible applications knowledge on behaviour of the wood with wood-decaying fungi was required. In wood block decay tests following norm EN 113 (1996), A. grandis wood as well as wood composites from A. grandis wood were easily degraded by brown-rot fungi but the wood showed a comparably good resistance against white-rot species. Earlywood and latewood in A. grandis wood was shown to different degrees to be affected by decay of different species over the incubation time. The brown-rot fungus Corniophora puteana caused higher mass loss for samples of earlywood+latewood than for samples of earlywood alone, as analyzed after 19 weeks of incubation. In contrast, the white-rot fungus Trametes versicolor caused a 2x higher mass loss of earlywood samples than of earlywood+latewood samples. Teatment of the wood with urea formaldehyde or ammonium sulphate however enhanced the resistance against white rot fungi. In contrast, wood extracted with water and with water+acetone lost resistance. Moreover, broken wood was easily degraded by fungi; likely, broken cells allow fungi an easy entry into wood cells. White-rot wood decay fungi were expected to secrete oxidative enzymes (laccase, peroxidases) in order to modify lignin within the wood cell walls. This modification of lignin results in quinones structures that can be stained with MBTH (3-methyl-2-benzothiazolinone-hydrazone hydrochloride monohydrate) resulting in a reddish color. The effects of oxidative enzymes on modification of wood cell walls were evaluated by staining wood sections with MBTH. Reddish staining of wood cell walls indicated modification of lignin within the wood cell walls. Staining of cell walls and cell wall thicknesses were reduced by longer incubation time of wood with T. versicolor, likely by massive degradation of lignin. Within year rings, the area fraction of stained cell walls (AS) and the total cell wall area (AT) was found to increase in a slightly sigmoid form from earlywood to latewood. The fungal actions on lignin were simulated through injections into solid A. grandis wood blocks using the redox-enzyme laccase with a mediator (HBT: 1-hydroxybenzotriazole, HBA: 4 hydroxybenzoic acid; both substances that interact with lignin upon oxidation by laccase) or individually with Mn3+ acetate, presenting a product of fungal Mn peroxidase known to act on lignocellulose. Reddish MBTH staining was slightly better with laccase with HBT than with HBA. Also, treatment with Mn3+ acetate resulted in a reddish color in the wood cell walls which was strongest with application of higher Mn3+ acetate concentrations (10 mM). The white-rot fungi Pleurotus ostreatus and T. versicolor are amongst the best laccase producers on A. grandis wood material when added to fungal cultures. Wood or wood extractives in concentration-dependent manner induced production of extracellular laccases but no manganese-dependent peroxidases (MnP), lignin peroxidases (LiP) or cellulases as fungal enzymes also acting on lignocellulose. Deduced from sub-culturing the fungi on medium with wood and different C and N contents, another general factor in laccase induction was likely the C to N ratio of the wood. Wood extractives from A. grandis were shown to inhibit growth of the white-rots Coprinopsis cinerea, P. ostreatus and T. versicolor, respectively. By gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), extractable wood compounds were identified. Within the water extractives and the acetone extractives, nine distinct phenolic compounds were found: 2-methoxyphenol (guaiacol), 4-hydroxybenzaldehyde, 1,4-dihydroxybenzene (hydroquinone), 3,5-di-tertbut-4-hydroxy-toluene (butylhydroxytoluol), 3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde (vanillin), 4-hydroxybenzoic acid, 3-methoxy-4-hydroxybenzoic acid (vanillic acid), 4-hydroxy cinnamic acid (p-coumaric acid), and 4-hydroxy-3-methoxy cinnamic acid (ferulic acid). Some of the natural phenolic compounds, such as 4-hydroxy cinnamic acid, 4-hydroxybenzaldehyde or 3,5-di-tertbut-4-hydroxy-toluene have a potential to act as natural inducers in laccase production of P. ostreatus and T. versicolor. Application of 1,4-dihydroxybenzene and p-benzochinone at the concentration of 1 mM to liquid cultures however inhibited growth of P. ostreatus and T. versicolor. Laccase isoenzymes of these two fungi induced in production by extractives were analyzed by native gel electrophoresis and identified by MS-analysis of peptides from specific proteolytic digests. Isoenzyme analysis detected laccase II in case of P. ostreatus and laccase I and laccase III in case of T. versicolor. A. grandis wood was further tested for potential technical use in enzymatic biofuel production. Experiments focused on effects of chemical, physico-chemical and biological pretreatments of the wood and, subsequently, onto cellulose hydrolysis by cellulase alone and in combination with other enzymes (xylanase, laccase and β glucosidase) in order to gain the highest glucose yields of transforming lignocellulosic substrate into fermentable sugars for biofuel production. In biological pretreatments, A. grandis wood mini blocks were incubated for 19 weeks with fungi according to EN 113 (1996). The biological pretreatment with P. ostreatus (compared to T. versicolor and C. puteana) gave excellent with conversion of 42.8% of the total original wood mass into glucose which corresponds to 92.4% of the cellulose that was originally present in the A. grandis wood. Application of 8 ml 85% phosphoric acid in a more energy consuming pretreatment for 1 hr at 50oC in a hot water bath resulted also in best glucose yields when applying each 4 U ml-1 of cellulase, xylanase and laccase. Longer incubation times and higher concentrations and amounts of phosphoric acid at a temperature pretreatment at 50oC lead to mass losses up to 50% and simultaneous relative increase of the cellulose content up to 100%. Highest glucose yields (up to 100%) were reached in a physico-chemical pretreatment by microwaving 1 g of wood particles in 8 ml of 85 or 80% phosphoric acid for 20 sec and applying subsequently a combination of 4 U ml-1 cellulase, 4 U ml-1 xylanase and 4 U ml-1 laccase or, alternatively to laccase, 4 U ml-1 β-glucosidase in 5 ml of 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.0 for hydrolysis for 24 hrs. Microwaving allowed reducing a phosphoric acid concentration below 80% to 40% and 20% in order to still obtain reasonable yields of sugars (60% of conversion of cellulose into glucose) in subsequent enzymatic hydrolysis of cellulose but only if cellulase and xylanase were applied together with laccase. Water extractives from A. grandis wood, respectively specific phenolic compounds (p-coumaric acid, vanillic acid and ferulic acid) within the water extractives were shown to act as inhibitors in hydrolysis of cellulose by cellulase. Phenolic compounds in wood extractives can be degraded by laccase activity, allowing better performance of cellulases in the production of glucose and explaining the observed positive effect of laccase in glucose production from cellulose from A. grandis wood.