Untersuchungen zur Charakterisierung der Virulenz von Isolaten des Virus der Klassischen Schweinepest beim Schwarzwild | Characterization of virulence of CSFV isolates originating from wild boar

TITEL / INHALTSVERZEICHNIS 1\. EINLEITUNG 1 2\. LITERATURÜBERSICHT 3 2.1. Virus der Klassischen Schweinepest 3 2.2. Verlaufsformen und Pathologie der Erkrankung 8 2.3. Pathogenese und Immunologie der Erkrankung 12 2.4. Faktoren, die den Erkrankungsverlauf beeinflussen 14 2.5. Die Klassische Schweinepest beim Schwarzwild 25 3\. MATERIAL UND METHODEN 31 3.1. Zelllinien 31 3.2. Virusstämme und -isolate 31 3.3. Zellkulturmedien 33 3.4. Chemikalien 34 3.5. Lösungen und Puffer 35 3.6. Seren, monoklonale Antikörper und Konjugate 38 3.7. Enzyme 38 3.8. Antibiotika 38 3.9. Geräte 39 3.10. Verbrauchsmaterialien 39 3.11. Tierexperimentelle Studien 40 3.12. Laborexperimentelle Studien 52 4\. ERGEBNISSE 61 4.1. Tierexperimentelle Studien 61 4.2. Laborexperimentelle Studien 85 5\. DISKUSSION 98 5.1. Tierexperimentelle Studien 98 5.2. Laborexperimentelle Studien 108 6\. ZUSAMMENFASSUNG 118 7\. SUMMARY 121 8\. LITERATUR 123

Das Ziel der Arbeit bestand in der Charakterisierung der Virulenz von 3 KSPV- Feldisolaten, die in den 1990er Jahren vom Schwarzwild in den Bundesländern Mecklenburg-Vorpommern bzw. Brandenburg isoliert wurden. Neben der in vivo- Charakterisierung der Isolate vom Genotyp 2.3 Rostock (2 Isolate aus Mecklenburg-Vorpommern) sowie 2.3 Güstrow (1 Isolat aus Brandenburg) sollten dabei auch in vitro-Methoden auf ihre Eignung zur Identifizierung des Virulenzgrades hin überprüft werden. Die tierexperimentellen Studien zur Pathogenitätseinstufung der KSPV-Isolate erfolgten jeweils an Haus- und Wildschweinen, um dem Einfluss von Wirtsfaktoren auf das Krankheitsbild Rechnung zu tragen und eventuelle Unterschiede im Krankheitsverlauf bei den beiden Schweinearten herauszuarbeiten. Auf Grund von Verlaufsform und Schweregrad der KSPV-Infektion wurde der Virulenzgrad des Infektionsvirus für jedes einzelne Tier sowie zusammenfassend für die jeweilige Schweineart festgelegt. Bei allen infizierten Hausschweinen, unabhängig vom eingesetzten Feldvirusisolat, verlief die Erkrankung subakut mit letalem Ausgang. Die 3 untersuchten Feldisolate erwiesen sich somit bei allen Hausschweinen als hochvirulent. Im Gegensatz dazu traten bei den Wildschweinen teilweise stark variierende Krankheitsverläufe auf. Ein Tier zeigte dabei ein chronisches Geschehen mit über den gesamten Versuchszeitraum persistierender Virämie und Virusausscheidung. Die zu charakterisierenden Isolate wurden auf Grund der unterschiedlichen Verläufe als insgesamt moderatvirulent für Wildschweine eingestuft. Mögliche Ursachen für die beobachteten Virulenzunterschiede zwischen den Wildschweinen bzw. zwischen Haus- und Wildschweinen sowie die Bedeutung chronischer Verlaufsformen bei Wildschweinen für das Seuchengeschehen im Feld werden diskutiert. Die Ergebnisse verdeutlichen die Abhängigkeit des Erscheinungsbildes der KSP von den Eigenschaften des Wirtes. In die Verfahren zur in vitro-Charakterisierung wurden zu Vergleichszwecken zusätzlich mehrere ältere Laborstämme vom Genotyp 1.1 mit unterschiedlichen Virulenzgraden einbezogen sowie ein weiteres in vivo schwachvirulentes Feldisolat des Genotypes 2.3 vom Schwarzwild. Bei der Durchführung von Ein- Schritt-Wachstumskinetiken ergab sich eine deutliche Beziehung zwischen der Vermehrung in vitro und der Zuordnung der Stämme und Isolate zu den verschiedenen Genotypen 1.1 bzw. 2.3. Eine Verbindung der zur Auswertung herangezogenen Kriterien zur Virulenz der Viren lag hingegen nicht vor. Die Analyse der Expression des Glykoproteins E2 im Verlauf der Wachstumskinetiken spiegelte ebenfalls eine Abhängigkeit vom Genotyp der betreffenden Viren, jedoch nicht vom in vivo gezeigten Virulenzgrad wider. Bei der Bestimmung von Plaquegrößen in infizierten Zellkulturen wurden keine Unterschiede zwischen den untersuchten KSPV festgestellt. Die in der Arbeit angewandten in vitro- Techniken ermöglichten entweder keine Einteilung der untersuchten Viren oder ließen Übereinstimmungen zwischen den jeweils genetisch enger verwandten KSPV, jedoch nicht zwischen Viren mit vergleichbarem Virulenzgrad erkennen. Zur Charakterisierung der Virulenz erwies sich somit das Tierexperiment von den hier untersuchten Methoden als die am besten geeignete.

The purpose of this study was to characterize the virulence of 3 CSFV field isolates obtained from wild boar in the 1990 s using in vivo and in vitro methods. The isolates belong to genotypes 2.3 Rostock (2 isolates from Mecklenburg-Western Pomerania) and 2.3 Guestrow (1 isolate from Brandenburg). A special focus of this work was to validate in vitro methods for their suitability to characterize the virulence of different CSFV strains. Infection experiments with each CSFV isolate were carried out using both, domestic pigs and wild boars, to elucidate the influence of host factors and species on clinical outcome and etiopathology. A virulence score for the respective CSFV isolate was calculated for every single animal as well as for the particular species of swine due to clinical course and severity of the virus infection. Independently of the applied CSFV isolate all infected domestic pigs showed a subacute etiopathology and a lethal outcome of the disease. All 3 tested CSFV field isolates proved to be highly virulent for the infected domestic pigs. In contrast wild boars partially showed a less homogenous clinical outcome. Especially in one of the wild boars the disease took a chronic course with viraemia and virus shedding during the entire experiment. Due to the more variable etiopathology the examined CSFV isolates were classified as moderately virulent for wild boars. Potential reasons for the differences in virulence scores of the tested virus isolates observed between individual wild boars and in comparison with domestic pigs are elucidated. Furthermore, the relevance of chronic CSFV infections in wild boars for the epidemiology of CSF is discussed. Taken together the results emphasize the impact of host factors for the outcome of a CSFV infection. Experiments for the in vitro characterization of CSFV additionally included several older isolates of genotype 1.1 representing different virulence scores as well as another field isolate from wild boar belonging to genotype 2.3. The latter proved to be low virulent in experimentally infected wild boars. One-step growth curves revealed a distinct correlation between in vitro multiplication and genotype of the tested CSFV isolates. On the other hand the analysed parameters showed no association to virulence of the respective viruses. Furthermore, glycoprotein E2 expression also appeared to depend on the genotype of the respective CSFV, but not on its virulence.