A Study on the Efficacy of selected Anthelmintic Drugs against Cyathostomins in Horses in the Federal State of Brandenburg, Germany | Untersuchungen zur Wirksamkeit ausgewählter Anthelminthika gegen Strongyliden- Infektionen bei Pferden im Bundesland Brandenburg

Grazing horses in intensive management face pastures contaminated with infective stages of a number of endoparasites on a daily basis. The management of equine premises as well as the veterinarians have in the past heavily relied on readily available and affordable drugs to treat infestations with parasitic helminths. Due to this fact, the prevalence of the formerly very common Large Strongyles has declined, and the Cyathostomins (CYA) have become the main intestinal parasites of the horse. Their distribution is worldwide, and they carry a high potential of clinical disease. Traditionally, control programmes have been based on anthelmintic drugs, to which CYA are becoming increasingly resistant. Three different drug classes with different modes of action are commercially available, the benzimidazoles (BZ), the tetrahydropyrimidines and the macrocyclic lactones (ML). Resistance of CYA has been detected to all three classes. The objective of this study was to investigate the efficacy of two commonly used anthelmintic drugs, in the German Federal State of Brandenburg: Ivermectin (IVM), a ML, and Pyrantel embonate (PYR), a tetrahydropyrimidine. The efficacy of both drugs was investigated with faecal egg count reduction tests (FECRTs) in two consecutive years. For IVM, the aim was also to detect a possible shortening of the egg reappearance period (ERP), which is considered a first warning sign for the development of resistance. A pre-selected population of horses kept on 24 farms scattered over the Federal State of Brandenburg was considered. These farms had shown a FEC for CYA higher than the average in a previous study, the horses had daily access to pasture or were kept in the field during the summer months. Premises that use anthelmintics infrequently, i.e. twice per year or less often (n=7), were compared with premises that worm their horses frequently, i.e. at least four times per year (n=17), since a risk factor associated with the development of resistance to anthelmintics is the frequent application of these drugs. In 2007, a FECRT with IVM was conducted in late summer/autumn on 23 of these 24 premises, with a total of 428 horses. In 2008, a FECRT with PYR was performed during the summer months on 21 of these 24 premises, and 414 horses were included. Faecal samples were analysed using a modified McMaster technique with a detection threshold of 25 eggs per gram (EPG). The weight of each animal was estimated, and a girth measuring tape was used to validate the estimation. The anthelmintic drugs were then applied according to weight. Horses of all ages with the exception of foals younger than six months were included in the study. The first FECRT (with IVM) was calculated in analogy to the recommendations of the WAAVP, which for cattle considers a FECR of <95% with a 95% LCL of <90% as ”Resistant”, and a result where only one of the two criteria is met as “Suspect resistant” (Coles et al. 1992). These recommendations propose a value of <90% as indicative of resistance to BZ in horses but give no value for the 95% LCL. Hence, in line with other recent equine AR-studies (Lester et al. 2013; Relf et al. 2014) the cut off was set at 90% FECR, and the 95% LCL was set at 80% in this study. The LCL was calculated according to WAAVP recommendations. For IVM, a FECR of 100% can be reported for 21 out of 23 farms (91.3%). On the remaining two farms (8.7%), one individual horse each had a faecal egg count (FEC) of 25 EPG, lowering total FECR to 99.73% and 98.33%, respectively. Anthelmintic drugs were used infrequently on both farms. A shortening of the ERP for IVM was not detected. Controversy exists among parasitologists concerning the calculation and interpretation of FECRTs, with regards to a) at what % of FECR the threshold for resistance should be set, and b), as to which method of calculation should be used. In this study, resistance was defined (i) in analogy to the recommendations for BZ by the WAAVP (mean FECR < 90%), with a lower 95% confidence limit (LCL) of <80% (Lester et al. 2013; Relf et al. 2014); and (ii) with the criteria as above, but also including the upper 95% limit (UCL) – the cut-off was set at UCL <95%, as suggested by Lyndal-Murphy et al. In order to assess the impact of the statistical method used, a total of three methods for the calculation of anthelmintic resistance were applied to the data sets of the FECRT for PYR: Firstly, the method for calculating FECRTs as currently recommended by the WAAVP was used, and resistance to PYR was detected on four farms (19%). Secondly, a bootstrapping method was employed together with four different equations for the calculation of FECRTs. These four different equations gave varied results: with equation 1, a FECR <90% was obtained on seven farms, with equations 2 and 3 on four farms, and with equation 4 on one farm. Thirdly, a Markov Chain Monte Carlo (MCMC) method was applied to the data. Resistance was detected on 17 farms (73.9%). This accounts for the WAAVP criteria of interpretation. When applying the criteria suggested by Lyndal-Murphy et al., only Farm N° 2 was detected as “Resistant”, by all three methods of calculation. There was huge variation in inference between statistical methods when using the WAAVP interpretation, but when using the Lyndal-Murphy interpretation all three statistical methods produced very similar recommendations in that there was conclusive evidence for resistance on yard No 2, but none of the other yards. Of the four farms on which resistance was detected according to the method of calculation as recommended by the WAAVP, two use anthelmintics frequently, and two infrequently. The hypothesis that frequent worming might enhance the development of resistance was therefore not confirmed. However, it was not possible to determine the frequencies in which each drug class had been used in the past, as the horse owners generally did not keep exact records. It is recommended that on these four farms routine FECRTs should be performed to monitor anthelmintic efficacy. A general agreement needs to be established on the calculation of FECRTs, and thresholds for the detection of resistance need to be created for each drug or drug class. Reports of resistance of equine helminths to all classes of anthelmintics available from all over the world have brought to attention non-chemical approaches to nematode control, as the reliance on anthelmintic treatments alone is not considered sustainable for parasite control in the future. New drug classes are momentarily not expected on the market, as costs for the development of a new drug are high, and the pharmaceutical industry does not regard the market for horses and livestock large enough as to invest in research for new anthelmintic drugs. This implies that the preservation of anthelmintic efficacy has to be of priority. However, it is necessary to involve the expertise of the veterinarian in the adoption of new parasite control programmes, as epidemiological principles need to be incorporated for sustainable control.

Pferde, denen unter intensiven Haltungsbedingungen Weidegang gewährt wird, sind täglich den infektiösen Stadien von Endoparasiten ausgesetzt und nehmen diese zusammen mit dem Weidegras auf. Pferdehalter, Stallbetreiber und auch Tierärzte haben in den letzten Jahrzehnten für die Wurmkontrolle stark auf die Wirksamkeit kommerziell erwerblicher Anthelminthika gesetzt. Dies führte zu einer Abnahme im Auftreten der vormals weit verbreiteten Großen Strongyliden und der mit ihnen assoziierten Kolik-Symptomatik. Mittlerweile sind Cyathostominae (CYA) die wichtigsten Endoparasiten des Pferdes; sie treten weltweit bei allen Equiden auf, und auch von ihnen geht ein hohes Pathogenitätsrisiko aus. Bekämpfungsmaßnahmen basieren traditionell auf dem regelmäßigen Einsatz von Anthelminthika; allerdings treten mittlerweile vermehrt Anthelminthika-Resistenzen auf. Derzeit sind auf dem Markt drei verschiedene Klassen von Anthelminthika erhältlich, die alle über einen unterschiedlichen Wirkmechanismus verfügen: Benzimidazole (BZ), Tetrahydropyrimidine und Makrozyklische Laktone (ML). Resistenzen der CYA sind allen drei Klassen gegenüber beschrieben worden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirksamkeit zwei verschiedener Anthelminthika im Bundesland Brandenburg zu überprüfen: Ivermectin (IVM), ein ML, und Pyrantel (PYR), ein Tetrahydropyrimidin. Zur Überprüfung der Wirksamkeit dieser Mittel wurden in zwei aufeinanderfolgenden Jahren zwei Eizahlreduktionstests (EZRTs) durchgeführt. Für den Wirkstoff Ivermectin war es außerdem Ziel der Arbeit, eine eventuelle Verkürzung der sogenannten Egg Reappearance Period (ERP), also der Zeit zwischen der Entwurmung und dem Wiederauftreten von Wurmeiern im Kot, festzustellen. Auf Grundlage der in einer Prävalenzstudie aus dem Jahr 2006 im Bundesland Brandenburg erhobenen Daten wurden für die vorliegende Studie 24 pferdehaltende Betriebe ausgewählt. Diese wiesen im Vergleich zu anderen Höfen Brandenburgs eine überdurchschnittlich hohe Eiausscheidung von CYA auf. Die Pferde werden stundenweise bzw. ganztägig auf der Weide gehalten. Es wurden Betriebe, die höchstens zweimal pro Jahr entwurmen, mit Betrieben verglichen, die mindestens viermal pro Jahr entwurmen. Dieser Unterteilung liegt die Annahme zugrunde, dass häufiges Entwurmen die Entstehung von Resistenzen gegen Anthelminthika fördert. Im Jahr 2007 wurde im Spätsommer und Herbst mit IVM ein EZRT auf 23 der 24 Betriebe und mit insgesamt 428 Pferden durchgeführt. Im Sommer 2008 wurde mit PYR auf 21 der 24 Betriebe mit insgesamt 414 Pferden ein EZRT durchgeführt. Die Analyse der Kotproben erfolgte mithilfe einer modifizierten McMaster-Technik. Die Nachweisgrenze lag bei 25 Eiern pro Gramm Kot (EPG). Die Bestimmung des Körpergewichtes erfolgte bei allen Pferden zunächst durch Schätzung, deren Ergebnis mit Hilfe eines handelsüblichen Maßbandes überprüft wurde. Die Dosierung des Anthelminthikums erfolgte nach Herstellerangaben gemäß Gewicht. Pferde aller Altersstufen ab einem Alter von sechs Monaten wurden in die Studie aufgenommen. Der im Jahr 2007 mit IVM durchgeführte EZRT wurde analog zu den Empfehlungen der World Association for Advancement in Veterinary Parasitology (WAAVP) berechnet. Diese Empfehlungen sehen bei Rindern eine EZR <95% und ein unteres 95% Konfidenzintervall von <90% als einen Hinweis für das Vorhandensein von Resistenzen an. Für Pferde wird bei BZ eine EZR von <90% als auf Resistenz hinweisend angesehen, und es wird kein Konfidenzintervall genannt. In Analogie hierzu wurde in der vorliegenden Studie eine EZR von <90% mit einem unteren 95% Konfidenzintervall von <85% als Grenzwert angesehen. Für IVM wurde auf 21 der 23 Betriebe eine EZR von 100% festgestellt. Auf den übrigen beiden Betrieben (8,7%) wurde bei jeweils einem Pferd eine Eiausscheidung festgestellt. Diese war minimal und betrug jeweils 25 EPG. Dadurch wurde die EZR auf den Betrieben auf 99,7%, bzw. 98,3% gesenkt. Die Entwurmung erfolgte auf diesen zwei Betrieben zweimal im Jahr oder seltener. Eine Verkürzung der ERP wurde für IVM nicht festgestellt. Der Grenzwert, ab dem von einer Resistenz gesprochen werden kann, wird in der Literatur kontrovers behandelt, ebenso, wie die Frage, welche Methode zur Berechnung der EZR angewendet werden sollte. In der vorliegenden Studie wurde das Vorhandensein von Resistenz nach zwei verschiedenen Kriterien definiert: 1. analog zu den Empfehlungen der WAAVP für BZ bei Pferden: EZR < 90% mit einem unteren 95% Konfidenzintervall von <80% (in Analogie zu Lester et al. (2013) und Relf et al. (2014)), und 2. zusätzlich mit dem oberen 95% Konfidenzintervall von <95% (von Lyndal-Murphy et al. empfohlen). Um die Auswirkungen verschiedener Berechnungsmethoden auf das Ergebnis beurteilen zu können, wurden drei verschiedene Methoden für die Berechnung der EZR auf die Daten des EZRT mit PYR im Jahr 2008 angewandt: Zunächst wurde die EZR nach der von der WAAVP empfohlenen Methode berechnet, und es wurden auch deren Kriterien für die Detektion einer Resistenz angewandt; hiermit wurde auf vier Betrieben (19%) eine Resistenz festgestellt. Desweiteren wurde eine bootstrapping-Methode angewendet, mit der die Berechnung mit vier verschiedenen Formeln durchgeführt wurde. Diese vier Formeln ergaben sehr unterschiedliche Ergebnisse: mit Formel 1 wurde eine EZR <90% auf sieben Betrieben festgestellt, mit den Formel 2 und 3 auf jeweils vier Betrieben und mit Formel 4 auf einem Betrieb. Drittens wurde eine Markov Chain Monte Carlo (MCMC) Methode für die Berechnung verwendet, mit der auf 17 Betrieben (73,9%) eine Resistenz festgestellt wurde. Mit den Kriterien nach Lyndal-Murphy et al. wurde für alle drei Berechnungsmethoden lediglich auf Hof N°2 eine Resistenz festgestellt. Es gab große Unterschiede zwischen den Ergebnissen der statistischen Methoden mit den Kriterien der WAAVP; bei Einbeziehung des oberen 95% Konfidenzintervalls hingegen fielen die Ergebnisse aller drei Methoden sehr ähnlich aus, da jeweils ausschließlich Hof N°2 als resistent erkannt wurde. Daher sollte in Zukunft auch das obere Konfidenzintervall für die Interpretation der Daten von FECRT herangezogen werden. Die Ergebnisse nach Berechnung gemäß den Empfehlungen der WAAVP lassen darauf schließen, dass die Wirksamkeit von PYR bei Pferden in Brandenburg im Allgemeinen als akzeptabel anzusehen ist. Dagegen kann bei vier Betrieben davon ausgegangen werden, dass eine nicht sensitive Population kleiner Strongyliden besteht. Von diesen vier Betrieben entwurmen zwei Betriebe höchstens zweimal pro Jahr und zwei Betriebe mindestens viermal pro Jahr. Die These, dass häufiges Entwurmen eine Resistenzentwicklung fördert, konnte in der vorliegenden Studie somit nicht bestätigt werden. Allerdings war es nicht möglich festzustellen, welche Wirkstoffklassen in der Vergangenheit eingesetzt wurden, da keiner der Betriebe exakte Aufzeichnungen hierüber führt. Es ist dennoch zu empfehlen, dass auf diesen Betrieben im Rahmen eines Programms zur Kontrolle des Endoparasitenbefalls regelmäßige EZRTs durchgeführt werden. Es besteht die Notwendigkeit einer grundsätzlichen Übereinkunft zur Berechnung von EZRTs; außerdem sollten für die einzelnen Wirkstoffgruppen Grenzwerte definiert werden, ab denen vom Vorhandensein einer Resistenz ausgegangen werden kann. Berichte aus mehreren Ländern über vermehrt auftretende Resistenzen bei Helminthen des Pferdes haben alternative Bekämpfungsmaßnahmen in den Fokus gerückt. Da der Marktanteil der Anthelminthika für Pferde von der pharmazeutischen Industrie nicht als wichtig genug erachtet wird, um in die Entwicklung neuer Wirkstoffklassen zu investieren, kann eine zukunftsfähige Wurmkontrolle nicht ausschließlich auf der Verwendung von Anthelminthika basieren. Dem Erhalt der Wirksamkeit der vorhandenen Anthelminthika ist eine ebenso hohe Bedeutung beizumessen wie der Einbindung tierärztlicher Expertise in die Planung und Durchführung der Wurmkontrolle unter Berücksichtigung der Epidemiologie der Parasiten.