Studies on the influence of zinc on trace element status of neonatal piglets and copper concentration in kidney of weaned piglets including zinc-related genes | Studien zum Einfluss von Zink auf den Spurenelementstatus neonataler Ferkel und die Kupferkonzentration in der Niere abgesetzter Ferkel, einschließlich zinkabhängiger Gene

Zinc (Zn) is a trace mineral which has to supply to man an animal via nutrition. Through its participation in approximately 6000 proteins, 300 metallo-enzymes and its uniqueness of metals in involvement of all six enzyme classes the importance for organisms is demonstrated. However, it is an ambivalent metal, considering Zn surplus and undersupply have severe consequences (see chapters 2.3 Zinc deficiency and genetic disorder in zinc metabolism and 2.4 Zinc poisoning). Thus, Zn could be the limited growth factor and consequently the sufficient concentration in piglets´ feed is indispensable. Therefore, we conducted a feeding trial of suckling piglets to investigate the effect of trace elements in mineral organ concentrations and expression of Zn-related genes (see Chapter 4: Influence of formula versus sow milk feeding on trace element status and expression of zincrelated genes in the jejunum, liver and pancreas of neonatal piglets). Randomly selected neonatal piglets were divided into two groups (n=8 per group). The control group stayed by their mothers, whereby the second group were separated from the sows after uptake of colostrum, held in acryl boxes in sets of two and received milk replacer for a trial period of 14 days. After experimental time, BW of both groups did not differ significantly to each other (approximately 5.0 kg). To determine mineral concentration of Zn, Cu, Mn and Fe, tissues of jejunum, pancreas and liver were analysed by atomic absorption spectrometry. While Zn concentration in liver tissue of formula (FO) suckled piglets was approximately threefold higher compared to sow milk group (569 mg/kg DM and 188 mg/kg DM, respectively; P<0.01), they did not differ in pancreatic and jejunal tissue. Furthermore, Cu concentration in analysed tissues were comparable between both groups. Both, Fe and Mn concentration increased significantly in liver and jejunum in FO fed group (P<0.05). Following, we determined mRNA contents by using real-time-PCR and subsequent calculated relative mRNA abundance by the use of housekeeping genes (succinate dehydrogenase subunit A, ß-microglobulin and ß-actin), mean ct and PCR efficiency. This way, relative contents of Zn transporter (ZnT1 and 2 for reducing cellular Zn and ZIP4 for increasing cellular Zn concentration), metallothionein (MT-1A, MT-2B and MT-3 as cellular storage and detoxification proteins), divalent metal ion transporter (DMT1, transporting several divalent ions across the cellular membrane) and a proinflammatory cytokine (interleukin (IL)-6), involved in Fe metabolism in liver tissue) mRNA were determined. Neither in pancreas nor in jejunum changes occur. But in liver tissue all determined MT isoforms and IL-6 increased significantly in FO group. On the contrary, ZnT1 and DMT1 were significantly higher in sow milk suckled piglets. Finally, Spearman´s correlation was executed to get a deeper insight into correlations of minerals and gene expression in liver tissue (see Table 4.5). In conclusion, accumulation of diverse minerals and increased MT expression in tissues of FO fed piglets, although fed concentration satisfied recommendation of NRC for very young, but weaned, piglets, let us propose the question, whether requirements are possibly lower as to date expected. Considering the rising number of litter size per sow and limited ability of nourish the piglets, artificial rearing systems and therefore composition of milk replacer are an instant problem. On the other hand, high dietary Zn concentration were used as antibiotic-free growth promoter in pig breeding for decades. Indeed, accumulation in different tissues and environmental pollution through excreted Zn were reported, dietary Zn up to the high of 3000 mg Zn/kg DM remains in weaning piglets´ nutrition (see chapter 2.5 Requirement and recommendation of zinc). Thus, we conducted an animal trial to examine the impact of Zn and Cu co-accumulation on mineral metabolism involved proteins in kidney tissue of weaned piglets after 14 and 28 days. Furthermore, we measured mineral concentrations of several tissues to evaluate whether prolonged pharmacological dietary Zn intake rise further on and if a regression of Zn tissue concentration occurs after 14 days of withdraw to required dietary Zn (see Chapter 5: Accumulation of copper in the kidney of pigs fed high dietary zinc is due to metallothionein expression with minor effects on genes involved in copper metabolism). Therefore, 40 weaned piglets were randomly divided into two groups (n=16 and 24, respectively) for the first two weeks and afterwards a third group was created and after further two weeks remaining 24 piglets were euthanized to take samples (n=8 per group). The tissue Zn concentration (measured by atomic absorption spectrometry) were higher in jejunum, liver, pancreas, and bone of high fed Zn group (HZn, 2100 mg Zn/kg DM) compared to normal dietary Zn group (NZn, 100 mg Zn/kg DM) after 14 and 28 experimental days, respectively. The group which switched from HZn to NZn after 14 days (CZn group) did not differ from NZn group, which indicated that Zn accumulation is reversible. Kidney tissue was the only of analysed tissues showing a Co-accumulation of Zn and Cu and a strong positive correlation to each other (R=0.67; P<0.05). Therefore, we determined relative mRNA concentration of Zn transporter (ZnT1, ZIP4), DMT1, MT-1a, MT-2b, MT-3 and genes which are involved in Cu metabolism (plasma membrane Cu transporter: Ctr1, Cu chaperons: Atox-1, CCS and ATP7A, Cu/Zn superoxide dismutase: SOD1 and a cytoplasmic binding protein ceruloplasmin: CP) in kidney tissue using real-time qPCR. Relative mRNA concentration of Cu metabolism involved proteins did not differ between time points and groups, apart from decreased Atox-1 after two weeks and increased Ctr1 over time in HZn group, respectively. Contrary, relative MT expression of all three measured iso-enzymes were higher in HZn group at both time points, compared to NZn and CZn group. Thereby, the most distinct effect was observed in MT-1a expression, followed by MT-2b and MT-3, possibly due to binding affinities or tempo of adaptation processes. To conclude, despite usually carefully regulated Zn homeostasis, counter regulation in jejunal absorption processes during excessive high dietary Zn concentration for two and four weeks did not protect against Zn accumulation in several tissues, which is an indicator for outbalanced homeostasis. Furthermore, Zn induced MT expression resulted in Cu Coaccumulation in kidney, whereby Cu metabolism involved genes did not adapt on transcription level. Indeed, all mentioned changes were reversible by a change to normal dietary Zn intake for two weeks. Nevertheless, further quantitative studies were required to determine the reason for renal co-accumulation of Zn and Cu, consequences on urinary element emission and body Cu status of piglets.

Zink (Zn) ist ein Spurenelement, das Menschen und Tieren über die Nahrung zugeführt werden muss. Seine außerordentliche Relevanz für den Organismus ist durch das Vorkommen in ca. 6000 Proteinen und 300 Metalloenzymen zu erkennen. Darüber hinaus kommt es als einziges Metall kommt es in allen sechs Enzymklassen vor. Allerdings ist es ein ambivalentes Metall, da sowohl Zn-Überschuss, als auch eine Unterversorgung mit Zn schwere Folgen haben können (siehe Kapitel 2.3 Zinc deficiency and genetic disorder in zinc metabolism and 2.4 Zinc poisoning). Dadurch kann Zn ein limitierender Wachstumsfaktor sein und eine bedarfsdeckende Versorgung über das Futter ist unerlässlich. Der Effekt von Mineralkonzentration in verschiedenen Organen und die Expression Znabhängiger Gene bei säugenden Ferkeln wurde in einem Fütterungsversuch untersucht (siehe Chapter 4: Influence of formula versus sow milk feeding on trace element status and expression of zinc-related genes in the jejunum, liver and pancreas of neonatal piglets). Dazu wurden zufällig ausgewählte, neonatale Ferkel in zwei Gruppen mit jeweils 8 Ferkeln eingeteilt. Die Kontrollgruppe blieb bei ihren Müttern, während die Tiere der zweiten Gruppe nach der Kolostrumaufnahme separiert wurden. Sie waren jeweils zu zweit untergebracht und bekamen für die Versuchszeit von 14 Tagen Milchaustauscher (MAT). Nach dieser Versuchszeit gab es zwischen beiden Versuchsgruppen keine signifikanten Unterschiede in der Körpermasse (ca. 5 kg). Die Mineralkonzentration im Jejunum-, Pankreas- und Lebergewebe wurde mittels Atomabsorptionsspektrometrie bestimmt und in mg/kg Trockenmasse (TM) angegeben. Während die Zn-Konzentration im Lebergewebe bei den mit MAT aufgezogenen Ferkeln ca. 3 Mal höher war als in der Kontrollgruppe (569 mg/kg TM bzw. 188 mg/kg TM; P<0.01), gab es keine Unterschiede in der Zn-Konzentration in Pankreas oder Jejunum. Allerdings fanden wir sowohl signifikant erhöhte Eisen- (Fe), als auch Mangan- (Mn) Konzentrationen in der Leber und dem Jejunum der MAT Gruppe (P<0,05). Anschließend bestimmten wir aus genannten Organen die mRNA unten genannter Gene mittels real-time-PCR und berechneten daraufhin relative mRNA-Gehalte, indem Haushaltsgene (Succinatdehydrogenase A, ß-Mikroglobulin uns ß-Aktin), mittlerer ct und PCR Effizienz verwendet wurden. So konnten wir relative Gehalte von Zn-Transportergenen (ZnT1 und 2 für die Reduktion der zellulären Zn-Konzentration und ZIP4 für die Erhöhung der zellulären Zn-Konzentration), Metallothioneine (MT-1a, MT-2b und MT-3 als zelluläre Speicher und Entgiftungsproteine), ein divalenter Metallionen Transporter (DMT1 als Transportprotein für verschiedene Ionen über die Zellmembran) und ein proinflammatorisches Cytokin (Interleukin 6, welches in den Fe-Metabolsimus involviert ist) bestimmen. Weder im Pankreas, noch im Jejunum wurden Veränderungen an genannten mRNA-Gehalten gemessen. In der Leber hingegen gab es in der MAT Gruppe einen signifikanten Anstieg von allen 3 bestimmten MT-Isoformen und Interleukin 6. Im Gegensatz dazu waren sowohl ZnT1-, als auch DMT1- mRNA Gehalte in der Kontrollgruppe signifikant erhöht. Um einen tieferen Einblick in die Korrelation zwischen Mineralkonzentration und Genexpression im Lebergewebe zu erhalten, führten wir eine Korrelationsanalyse nach Spearman durch (siehe Tabelle 4.5). Da es keine Empfehlungen für Ferkel-MAT gibt, jedoch einige auf dem Markt zu finden sind, hielten wir uns an die GfE- und NRC-Empfehlungen für sehr junge (allerdings abgesetzte) Ferkel und an die Zusammensetzung von MAT, die in früheren Studien genutzt wurden. Da dies zur Akkumulation verschiedener Mineralstoffe und einem signifikanten Anstieg der Expression von MT in Geweben der mit MAT ernährten Ferkel führte, wirft es die Frage auf, ob der Bedarf an Mineralstoffen niedriger ist, als derzeit angenommen. Durch die steigende Anzahl der Ferkel je Sau und Wurf und die limitierte Fähigkeit ihrer Ernährung durch die Sau, ist die Aufzucht mit Hilfe von MAT und folglich deren Zusammensetzung, ein dringendes Problem, das weitere Forschung bedarf. In einem weiteren Bereich der Schweineaufzucht, dem der abgesetzten Ferkel, werden Mineralstoffe, insbesondere hohe diätetische Zn-Zulagen bis zu 3000 mg Zn/kg Futter), seit Jahrzehnten als antibiotikafreie Wachstumsförderer eingesetzt. Allerdings kommt es dadurch sowohl zu massiver Umweltbelastung, durch ausgeschiedenes Zn, als auch zur Akkumulation in verschiedenen Geweben der Ferkel (siehe Kapitel 2.5 Requirement and recommendation of zinc). Um den Einfluss der Co-Akkumulation von Zn und Cu auf Proteine der Niere, die beim Mineralmetabolismus involviert sind, zu untersuchen, erfolgten Messungen bei abgesetzten Ferkeln nach 14 und 28 Tagen. Des Weiteren wurden auch in diesem Versuch die Konzentrationen verschiedener Mineralstoffe in unterschiedlichen Geweben mittels Atomabsorptionsspektrometrie gemessen, um zu evaluieren, ob pharmakologisch hohe Zn-Zulagen im Futter die Gehalte im Gewebe weiter ansteigen lassen und ob es nach 14 Tagen einen Rückgang der Zn-Konzentration in den Geweben gibt, wenn die Zn-Zulagen wieder verringert werden (siehe Chapter 5: Accumulation of copper in the kidney of pigs fed high dietary zinc is due to metallothionein expression with minor effects on genes involved in copper metabolism). Dazu wurden 40 abgesetzte Ferkel zufällig in zwei Gruppen eingeteilt (n=16 und n=24). Nach 14-tägiger Versuchsdauer wurden jeweils 8 Tiere beprobt und eine dritte Gruppe eröffnet, sodass nach weiteren 14 Tagen Proben von den verbleibenden Ferkeln (n=8 pro Gruppe) gewonnen wurden. Die Zn-Konzentration in der Gruppe mit hohen Zn-Zulage im Futter (HZn Gruppe, 2100 mg Zn/kg TM) war in Jejunum, Leber, Pankreas und Knochen im Vergleich zu bedarfsgedeckten Zn-Gruppe (NZn, 100 mg Zn/kg TM), sowohl nach 14, als auch nach 28 Tagen Versuchsdauer signifikant erhöht. Da sich der Zn-Gehalt in den genannten Geweben der Ferkel der angepassten Gruppe (CZn, 14 Tage HZn und anschließend 14 Tage NZn) sich nach 28 Tagen nicht von der NZn Gruppe unterschied, kann geschlussfolgert werden, dass diese Akkumulation reversibel ist. Des Weiteren war die Niere das einzige Gewebe, das eine Co-Akkumulation von Zn und Cu und eine starke positive Korrelation zueinander aufwies (R=0.67; P<0.05). Weiterhin bestimmten wir durch real-time qPCR die relativen mRNA Gehalte von Zn-Transportern (ZnT1, ZIP4, DMT1, MT-1a, MT-2b, MT-3) und Genen, die den Cu-Metabolismus beeinflussen (Cu Transporter der Plasmamembran: Ctr1; Cu-Chaperonen: Atox-1, CCS, ATP7A; Cu/Zn-Superoxid Dismutase: SOD1 und cytoplasmatisches Bindungsprotein Ceruloplasmin: CP) im Nierengewebe der Ferkel. Abgesehen von Atox-1 und Ctr1, die jeweils in der HZn Gruppe anstiegen, gab es keine Veränderung der relativen mRNA Gehalte der am Cu-Metabolsimus beteiligten Gene. Im Gegensatz dazu stieg die relative mRNA Expression aller MT-Isoenzyme der HZn Gruppe im Vergleich zu NZn und CZn Gruppe an. Dabei war der größte Effekt bei der Expression von MT-1a zu beobachten, gefolgt von MT-2b und MT-3. Mögliche Ursachen sind entweder die Geschwindigkeit der Expressionsanpassung oder unterschiedliche Bindungsaffinitäten gegenüber den Mineralstoffen. Zusammenfassend ist festzustellen, dass trotz der äußert sensibel regulierten Homöostase von Zn, die Gegenregulation im Absorptionsprozess des Darms nicht ausreicht, um vor Zn-Akkumulation in verschiedenen Organen nach zwei- bzw. vierwöchiger exzessiv hohe Zn-Aufnahmen zu schützen, was ein Indikator für eine Störung der Homöostase ist. Darüber hinaus resultiert die erhöhte Zn-induzierte Expression von MT in einer Co-Akkumulation von Cu im Nierengewebe, wohingegen die Gene des Cu-Metabolismus auf dem Level der Transkription nicht beeinflusst werden. Anzumerken ist, dass alle genannten Prozesse nach 14 Tagen bedarfsdeckender Zn-Zugabe reversibel sind. Nichtsdestotrotz werden weitere, quantitative Studien benötigt, um die Gründe der ausschließlich renalen Co-Akkumulation und ihre Konsequenz für die eventuelle Ausscheidung der Mineralstoffe mit dem Urin und den Cu-Status von Schweinen zu beurteilen.