Untersuchung der Effekte von Enterococcus faecium (probiotischer Stamm NCIMB 10415) und Zink auf die angeborene Immunantwort im Schwein | The effects of probiotics and zinc supplementation on the porcine innate immune response

Die Besorgnis über die Entstehung bakterieller Resistenzen sowie vor einem möglichen Transfer von Antibiotika-Resistenzgenen führte im Jahr 2006 zu einem europaweiten Verbot des Einsatzes von Antibiotika als Leistungsförderer in der Schweinemast. Aufgrund hoher Verlustraten bei der Ferkelaufzucht, meist verursacht durch Durchfallerkrankungen vor allem in der Zeit vor dem Absetzen der Ferkel und wenige Tage danach, ist die Dringlichkeit hoch, Alternativen für Antibiotika zu finden. Eine Möglichkeit ist die Verwendung spezieller Futterzusatzstoffe, beispielsweise von probiotischen Mikroorganismen, aber auch von Zink. Probiotika fördern den Barriereeffekt der Darmflora, reduzieren die Besiedlung des Darms durch pathogene Bakterien, ihr Wachstum sowie die Stoffwechselaktivität und verhindern so ihre Ausbreitung. Die Immunantwort wird außerdem durch Probiotika unterstützt. Sie lösen u. a. die Bildung von Zytokinen und Antikörpern aus. Außerdem verfügen Probiotika über die Fähigkeit, die Zusammensetzung von Darmflora und Darmmilieu zu verändern. Das essentielle Spurenelement Zink beeinflusst viele Aspekte des angeborenen und des adaptiven Immunsystems. Des Weiteren wurde für Zink eine bakterizide Wirkung beschrieben. Problematisch ist, dass eine pharmakologische Wirkung erst bei sehr hohen Konzentrationen (3000 – 6000 ppm) auftritt. In diesem Zusammenhang wurde schon über einige negative Folgen berichtet. Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um das Teilprojekt B8 des DFG- Sonderforschungsbereichs SFB 852 „Ernährung und intestinale Mikrobiota – Wirtsinteraktion beim Schwein“ mit der Zielsetzung, die Effekte und Wirkungsweisen von Futterzusätzen (Enterococcus faecium SF68 [NCIMB 10415, Cyclatin®] und ZnO) auf die angeborene Immunantwort von Schweinen gegenüber intestinalen Pathogenen in vivo und im Infektionsmodell zu untersuchen. Als Infektionsmodell wurden die enteropathogenen Salmonellen verwendet. In vier unterschiedlichen Tierversuchen wurden Blut- und Gewebeproben entnommen und mittels quantitativer Real-time PCR die Genexpression immunrelevanter Gene in Kontroll- und Versuchsgruppen überprüft. Dabei wurde die Genexpression von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen (IL-8, IL-10), die des ko- stimulatorischen Proteins CD86 (T-Zell-Aktivierung) und des inhibitorischen Proteins CTLA4 (T-Zell-Anergie) untersucht. Daneben wurden auch intrazelluläre (Nod1, Nod2) sowie sezernierte (PGLYRPs) Erkennungsproteine für Peptidoglykan untersucht. Im E. faecium SF68-Fütterungsversuch konnte während der Periode vor dem Absetzen in intestinalen Geweben eine pro-inflammatorische Immunantwort auf geringem Niveau, charakterisiert durch eine erhöhte Genexpressionsrate von IL-8/CXCL8, beobachtet werden. Nach dem Absetzen konnte ein Wechsel hin zu einer anti-inflammatorisch ausgerichteten Immunantwort detektiert werden. Diese wurde durch signifikant reduzierte Expressionen von IL-8 und CD86 in den ilealen Peyer´schen Platten der Probiotika-Tiere im Vergleich zu den Kontrolltieren sichtbar. Insgesamt scheint es eine altersabhängige Genexpression von IL-8 zu geben, bei der das Absetzen der Ferkel eine entscheidende Rolle spielt. Teile dieser Ergebnisse wurden schon veröffentlicht (Siepert et al., 2014; Twardziok et al., 2014). Die Beobachtungen und Ergebnisse aus den Tierversuchen mit E. faecium SF68 (Fütterungsversuch und Salmonella challenge Versuch) konnten insgesamt zeigen, dass eine anhaltende Fütterung von Sauen und ihren Ferkeln mit dem probiotischen Stamm E. faecium SF68 zu einer anti-inflammatorischen bzw. immunsuppressiven Immunantwort in den Ferkeln führt, welche vor allem in der Phase nach dem Absetzen sichtbar wird. Beispielsweise könnten die im Salmonella challenge E. faecium SF68-Versuch detektierten erhöhten Bakterienlasten, die reduzierte bzw. verzögerte Proliferationsantwort der PBMCs als Antwort auf Salmonella-Antigene, aber auch die Veränderungen bei den Immunzellpopulationen nach Fütterung der Tiere mit E. faecium SF68 durch eine anti-inflammatorische Wirkung von E. faecium SF68 erklärt werden. Parallel zu den In-vivo-Versuchen wurden permanente porzine intestinale Epithelzellen (IPEC-J2) und Makrophagen-ähnliche Zellen (3D4/31; PLN/C2) verwendet, die chromosomal-integrierte, NF-κB-abhängige Reporterkonstrukte enthalten, um so eine Untersuchung der Effekte des Probiotikums, der zellfreien Bakterienlysate oder von anderen Futterzusatzstoffen (Zink) auf die angeborene Immunantwort in den Wirtszellen zu ermöglichen. Insgesamt scheinen die zellfreien E. faecium SF68-Lysate einen starken inhibitorischen Effekt auf die NF-κB-Aktivierung in porzinen Zellen zu haben. Es konnte eine Inhibierung der NF-κB-Aktivierung deutlich unter das basale Level der unbehandelten Zellen beobachtet werden. Diese Inhibierung lässt sich in den IPEC-J2 durch keinen eingesetzten Stimulus (S. Typhimurium-Infektionen, LPS- oder TNF-α-Zugabe bzw. E. coli-Bestandteile) im beobachteten Zeitraum wieder aufheben. Um die bakterielle Komponente aus dem zellfreien E. faecium SF68-Lysat, welche für den anti-inflammatorischen Effekt verantwortlich ist, enger einzukreisen, wurden verschiedene Untersuchungen zur näheren Charakterisierung gemacht. Insgesamt ist festzuhalten, dass die Inhibierung der NF-κB-Aktivierung auf eine proteinhaltige, relativ hitzebeständige Struktur zurückgeht. Die Inhibierung der NF-κB-Aktivierung ist sowohl abhängig von der eingesetzten Konzentration als auch der Behandlungsdauer und scheint größtenteils irreversibel im untersuchten Zeitraum zu sein. Es konnte weiter gezeigt werden, dass weder zytotoxische Effekte noch apoptotische Vorgänge für die Suppression der NF-κB- Aktivierung verantwortlich sind. Aufgrund der lang anhaltenden Inhibierung der NF-κB-Aktivierung kommt es vermutlich zu einer Dysregulation der Genexpression verschiedener NF-κB-Zielgene, was auch der Grund für eine verminderte metabolische Aktivität der Zellen sein könnte. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass die inhibitorische Aktivität einer Protein-Komponente im E. faecium SF68-Lysat nicht nur die Aktivierung von NF-κB als Reaktion auf eine Infektion mit Salmonella, LPS oder TNF-α verhindert, sondern auch zu einer starken Inhibierung der Zellproliferation führt (persönliche Mitteilung, Dr. Karsten Tedin). Die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Charakteristika (Protein bzw. proteinhaltige Struktur, relativ hitzestabil, Proteinase K-sensitiv) der für die Inhibierung der NF-κB-Aktivierung verantwortlichen Substanz könnten auf ein Enterococcus Enterozin hinweisen. In der Literatur konnte schon für unterschiedliche Bakteriozine/Enterozine eine Inhibierung der NF-κB-Aktivierung nachgewiesen werden. Zur Untersuchung der Wirkungsweise von Zink auf die angeborene Immunantwort im Schwein wurde zunächst überprüft, welchen Effekt die Deletion verschiedener Gene bzw. die Gabe von exogenem Zink auf die Virulenz und Pathogenese von S. Typhimurium hat. Dazu wurden ∆znuA-, -B- und -BC-, ∆zur-, ∆zraP-, ∆mntH-, ∆zirS-, ∆zirT- und ∆zirTS- Deletionsmutanten hergestellt und hinsichtlich ihrer Invasionseffizienzen und intrazellulären Persistenz in porzinen intestinalen Epithelzellen (IPEC-J2) und Makrophagen-ähnlichen Zellen (3D4/31, PLN/C2) überprüft. Diese Gene codieren für ein Zink-Aufnahmesystem (ZnuABC) und den dazugehörigen Repressor (Zur), ein zinkabhängiges NRAMP-Homolog (MntH), welches ein Metallionen- Transporter ist, ein Protein (ZraP), welches in die Zink-Toleranz involviert ist sowie ein alternatives, von der Zink-Konzentration im umgebenden Medium abhängiges Sekretionssystem (ZirTS). Insgesamt zeigten die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen der Deletionsmutanten, dass es viele zinkabhängige Systeme mit essentieller Bedeutung in S. Typhimurium gibt. Diese Beobachtungen sind die Grundvoraussetzung für einen sinnvollen Einsatz von Zink als vorbeugende Maßnahme gegenüber bakteriellen Infektionen. Im nächsten Schritt wurde innerhalb eines Zinkoxid-Fütterungsversuches und eines Salmonella challenge Versuches die Expression verschiedener immunrelevanter Gene (IL-8, IL-10, CD86, PGLYRP-1, -2A und 2B, Nod1 und Nod2) überprüft und damit die Bedeutung von Zink auf die Expressionsraten dieser Gene untersucht. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine Zinkoxid-Fütterung nach dem Absetzen zu einer eher anti-inflammatorisch ausgerichteten Immunantwort führt. Bei einer Infektion mit Salmonella 32 Tage post partum konnten zwei Tage post infectionem in den Geweben der intestinalen Wand, mit Ausnahme der ilealen Peyer´schen Platten in Gruppe C, wo die Expression von IL-8 signifikant erhöht war, keine wesentlichen Unterschiede hinsichtlich einer Zinkoxid-Fütterung beobachtet werden. Zum späten Zeitpunkt, 42 Tage post infectionem, konnte dagegen eine, zum Teil auch signifikant, erhöhte Expression von IL-8, der PGLYRPs und der Nod-Proteine in den Geweben der intestinalen Wand (IlePP, JePP) und den mesenterialen Lymphknoten beobachtet werden. Dies deutet auf eine starke inflammatorische Immunantwort sowie eine erhöhte Translokation des gastrointestinalen Pathogens hin. Insgesamt konnten die Resultate der vorliegenden Arbeit einen Wirkmechanismus von E. faecium SF68 aufzeigen, der viele der zuvor in anderen Studien gesehenen Ergebnisse erklären könnte. Ferner konnte auch für die Gabe/Fütterung von Zink sowohl eine Auswirkung auf den Modellorgansimus (S. Typhimurium) als auch auf die Genexpression immunrelevanter Gene im Schwein beobachtet werden.

The worldwide concern about the development of antimicrobial resistance and the possibility of a transfer of antibiotic resistance genes led to banning the use of antibiotics as growth promoters in swine production in the European Union since January 1, 2006. Due to the high number of piglet losses - mainly caused by diarrhea during the weaning period - viable alternatives to antibiotics are needed. One possibility is the use of specific feed additives such as probiotics or zinc. Probiotics enhance the barrier effect of the intestinal flora, reduce pathogenic bacterial colonization of the intestine, their growth and metabolic activity and prevent their distribution. Another mode of action is the modulation and support of the hosts immune response. The administration of probiotics induces the production of cytokines and antibodies, amongst others. In addition, probiotics have the ability to modulate the composition of the intestinal flora and alter the intestinal environment. Zinc is an essential trace element and exhibits a strong effect on both, the innate as well as the adaptive immune system. Antibacterial activity of zinc was also described. The main problem for the use of zinc as an alternative growth promoter is that pharmacological effects occur only with unusually high concentrations (3000 – 6000 ppm). In this context different negative effects have already been reported. This project was part of the Collaborative Research Group (SFB) 852 “Nutrition and intestinal microbiota - host interactions in the pig” with the major goals to determine the effects and mechanisms of feed additives (E. faecium SF68 [NCIMB 10415, Cyclatin®] and ZnO) on innate immune responses to intestinal pathogens in swine both in vivo and using a Salmonella infection model. In four different animal trials, tissue and blood samples were taken from the piglets and analyzed using Real- Time quantitative PCR to determine the gene expression of immunologically relevant genes in control and experimental groups. The gene expression of pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-8, IL-10), T-cell co-stimulatory protein CD86 (T cell activation) and inhibitory protein CTLA4 (T cell anergy) were studied. In addition, both intracellular (Nod1, Nod2) and secreted (PGLYRPs) Peptidoglycan Recognition Proteins were also examined. In feeding trials of sows and piglets with the probiotic E. faecium NCIMB 10415 (SF68) we observed an apparent low-level inflammatory response in intestinal tissues of pre- weaning piglets in the probiotic group (age 12 and 26 days post partum) as indicated by elevated levels of the pro-inflammatory chemokine IL-8/CXCL8. Post-weaning however, a switch to an apparent anti-inflammatory response was observed, characterized by significantly reduced levels of IL-8 and CD86 in ileal Peyer´s patches relative to control animals, suggesting a post-weaning anti-inflammatory response. Furthermore there appeared to be an age-dependent gene expression of IL-8 in which weaning plays a key role. Portions of this work have already been published (Siepert et al., 2014; Twardziok et al., 2014). The results and observations of the clinical trials (E. faecium SF68 feeding trial, Salmonella challenge study) strongly suggest that prolonged supplementation of sows and piglets with E. faecium SF68 probiotic strain results in a local, anti-inflammatory or immunosuppressive response in intestinal mucosal tissues which becomes highly apparent post-weaning. These results provide a mechanism explaining prior observations made with E. faecium NCIMB 10415 regarding higher bacterial loads and shedding in two, independent Salmonella challenge studies, reduced or delayed cytotoxic effects of PBMC preparations in vitro, as well as changes in populations of regulatory T cells and cytolytic CD8β+ T cells. In parallel to the in vivo studies, permanent porcine intestinal epithelial (IPEC-J2) and macrophage cell lines (3D4/31; PLN/C2) harbouring chromosomally-integrated, NF-κB-dependent reporter fusions were used to determine the effects of probiotics, their products (E. faecium SF68 lysates - cell wall components, etc.), and other feed supplements (zinc) on host innate immune responses. I show in this work that cell-free lysates of E. faecium SF68 have a strong inhibitory effect on NF-κB activation in porcine intestinal epithelial and macrophage cell lines. E. faecium SF68 suppressed the activity of NF-κB below the basal levels of expression in untreated cells. This inhibitory activity also prevented the activation of NF-κB in response to different stimuli such as Salmonella infections, Gram-negative LPS, TNF-α, E. coli cell components. To further characterize the component responsible for the inhibitory effect on NF-κB activation, several studies were performed. In summary, it is clear that a relatively heat-resistant protein product of E. faecium SF68 is responsible for the inhibitory effects on NF-κB activation. The effect depends on the applied concentration as well as the duration of the treatment and appears to be irreversible during the period examined. Assays for cell cytotoxicity as well as apoptosis demonstrate that these effects played no role in the inhibition of NF-κB activation through E. faecium SF68. The prolonged inhibition of NF-κB activation likely leads to a dysregulation of the gene expression of different NF-κB target genes, explaining a reduced metabolic activity of lysate treated cells. The inhibitory activity of the protein product of E. faecium SF68 also strongly inhibits cell proliferation, as determined by antibody staining against the proliferation marker Ki67 (personal communication, Dr. Karsten Tedin). Different characteristics determined in this study of the component responsible for the inhibitory effect (protein product, heat-resistant, sensitive to Proteinase K) may indicate an Enterococcus Enterocine, consistent with prior studies showing inhibitory effects of different Bacteriocines/Enterocines on NF-κB activation. To investigate the effects of zinc on innate immune response and with regard to the zinc supplementation trials, a number of directed deletion mutants in genes involved in zinc transport and regulation in Salmonella Typhimurium were constructed to determine whether the virulence and/or pathogenesis of Salmonella could be affected by exogenous zinc as a feed supplement. Mutants were constructed with deletions for the genes mntH, znuA, znuB, znuBC, zur, zraP, zirS, zirT, or zirTS, and were tested in in vitro infection assays to determine the effects on host cell invasion and intracellular growth within the porcine intestinal epithelial cell line IPEC-J2 and porcine macrophage cell lines 3D4/31 and PLN/C2. The investigated genes encode for a high- affinity zinc uptake system (ZnuABC) and its regulator (Zur), a zinc-dependent NRAMP homologue (MntH) which is a divalent metal ion transporter, a protein involved in zinc tolerance (ZraP) as well as for a new alternative secretion system (ZirTS) whose expression is dependent on zinc. Overall, the results of these assays showed many essential zinc-associated systems in S. Typhimurium, and that the virulence and/or pathogenesis of Salmonella could be affected by exogenous zinc. This observation is an important prerequisite for the use of zinc as a preventative measure against bacterial infections. In a further study in vivo, I investigated the gene expression levels of different immunologically relevant genes (IL-8, IL-10, CD86, PGLYRP-1, -2A und 2B, Nod1 and Nod2) during a zinc supplementation and Salmonella challenge ZnO trial in order to study the relevance of additional zinc treatment. Overall, the results indicate that high zinc supplementation leads to an anti-inflammatory immune response post-weaning. After an infection with S. Typhimurium 32 days post partum no differences regarding zinc supplementation could be observed in the expression of immunologically relevant genes in intestinal tissues 2 days post infectionem, with the exception of the ileal Peyer´s Patches in one of the supplemented groups, where the gene expression of IL-8 was significantly increased. Interestingly, at the latest time point, 42 days post infectionem, increased gene expression of IL-8, PGLYRPs and Nod proteins in tissues of the intestinal wall (IlePP, JePP) and mesenteric lymph nodes was observed. This is suggested to reflect an inflammatory immune response and an increased translocation of the gastrointestinal pathogen. In summary, the results of the present work provide a mechanism explaining many prior observations made with the probiotic E. faecium SF68. Moreover, it was found that zinc supplementation/treatment affects both host invasion and persistence of S. Typhimurium as well as gene expression of immunologically relevant genes in a porcine model.