Etablierung und Charakterisierung eines Tumorsurrogat-Angiogenese-Modells und erste pharmakologische Wirksamkeitsnachweise antiangiogener Substanzen mittels kontrastverstärktem Mikro-Ultraschall | Establishment of an in vivo tumor surrogate angiogenesis model for testings of new antiangiogenic drugs

In dieser Arbeit wurde ein Tumorsurrogat-Angiogenese-Modell zur in vivo Quantifizierung von antiangiogenen Therapieeffekten etabliert und mit dem kontrastverstärkten Mikro- Ultraschall charakterisiert. Hierfür wurden zunächst drei unabhängige tierexperimentelle Studien durchgeführt, in denen die Angiogenese im Modell sonographisch und histologisch untersucht wurde. Danach erfolgte in einem vierten Experiment der erstmalige Einsatz des Tumorsurrogat-Angiogenese-Modells in einem antiangiogenen Therapie-Versuch. Im ersten Versuch wurden immundefizienten Tieren AlgB-Depots subkutan injiziert, die in vivo durch diffundierende proangiogene Wachstumsfaktoren die gerichtete Angiogenese induzierten. Es konnte gezeigt werden, dass ins AlgB-Depot einsprossende Blutgefäße mit dem kontrastverstärkten Mikro-Ultraschall detektiert und ein signifikanter Unterschied im Vaskularisierungsgrad zwischen Wachstumsfaktoren enthaltenden und –freien AlgB-Depots quantifiziert werden konnten. Die Ergebnisse konnten durch eine positive Korrelation zwischen sonographisch gemessener Kontrastsignalintensität und histologisch ermittelter Blutgefäßprofildichte unter Verwendung stereologischer Werkzeuge bestätigt werden. Das zweite Experiment diente der sonographischen Verlaufsuntersuchung einer Angiogenese in Wachstumsfaktoren enthaltenden und –freien AlgB-Depots. Angelehnt an den ersten Versuch erhielten immundefiziente Tiere AlgB-Depots mit oder ohne Wachstumsfaktoren. Die fortschreitende Vaskularisierung der individuellen AlgB-Depots wurde sonographisch verfolgt. Bereits frühzeitig nach Versuchsbeginn konnte ein signifikanter Gruppenunterschied sonographisch gemessen werden, der am Versuchsende am deutlichsten ausgeprägt war und signifikant mit den histologisch ermittelten Blutgefäßprofildichten korrelierte. Im dritten Tierexperiment wurde aufbauend auf Versuch zwei die sonographische Verlaufsuntersuchung in immunkompetenten Versuchstieren durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass der unterschiedliche Immunstatus sich nicht auf die sonographische Angiogenese-Messung auswirkte. Abschließend wurde das Tumorsurrogat-Angiogenese-Modell in einem ersten Therapie- Versuch getestet. Wachstumsfaktoren enthaltende AlgB-Depots wurden immunkompetenten Mäusen subkutan injiziert. Ein Teil der Tiere wurde täglich mit Bevacizumab, einem antiangiogen wirkenden monoklonalen Antikörper gegen VEGF behandelt, der andere Teil erhielt ebenfalls täglich Regorafenib, einen in der Entwicklung befindlichen antiangiogen wirkenden Multityrosinkinase-Hemmer der Bayer Schering Pharma AG. Für beide Gruppen wurden Kontrollgruppen angesetzt, die nur mit dem jeweiligen Trägerstoff von Bevacizumab bzw. Regorafenib behandelt wurden. Die sonographische Messung der Vaskularisierung der individuellen AlgB Depots wurde einmal wöchentlich durchgeführt und die Hemmung der Angiogenese konnte quantitativ dargestellt werden. Ein signifikanter Unterschied zwischen den mit Trägerstoff behandelten und den antiangiogen behandelten AlgB-Depots konnte frühzeitig sonographisch gemessen werden. Auch hier zeigte die Korrelation der sonographischen Daten mit den stereologisch ermittelten histologischen Daten einen deutlichen Zusammenhang zwischen Blutgefäßprofildichte und Kontrastsignalintensität. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der kontrastverstärkte Mikro-Ultraschall eine schnelle, effiziente und minimal invasive Methode zur Quantifizierung von antiangiogenen Effekten im Tumorsurrogat-Angiogenese-Modell ist. Das TSAM konnte in seiner modifizierten Form etabliert werden und bietet sich als schonendes Tiermodell zur Routine-Testung neuer potentiell antiangiogen wirkender Substanzen an. Die Kombination des TSAM mit dem kontrastverstärkten Mikro-Ultraschall bietet erstens den Vorteil eines sensitiven Nachweises von antiangiogenen Therapieeffekten in vivo. Zweitens kann durch die individuellen Verlaufsuntersuchungen die Anzahl an Versuchstieren pro Gruppe deutlich reduziert werden, da nicht mehr für jeden Untersuchungszeitpunkt histologische Untersuchungen durchgeführt werden müssen. Drittens bedeutet das TSAM zusätzlich eine Reduzierung der Versuchstierbelastung, da keine malignen, schnell wachsenden und oft metastasierenden und nekrotisierenden Tumore mehr eingesetzt werden müssen, welche aus tierschutzrechtlichen Gründen oft zum vorzeitigen Versuchsabbruch führen. Das etablierte Modell ist in Verbindung mit dem kontrastverstärkten Mikro-Ultraschall für die routinemäßige pharmakologische Charakterisierung neuer antiangiogener Substanzen in der biomedizinischen Forschung sehr gut geeignet.

In this doctoral thesis a tumor surrogate angiogenesis model for in vivo quantitation of antiangiogenic therapeutic effects was established and characterized by using contrast enhanced micro-ultrasound. For this purpose, initially three animal experiments were conducted where angiogenesis of the surrogate model was investigated both with microultrasound and histology. Finally, the surrogate model was used in a therapeutic setting for the first time. The first experiment was conducted by using immunodeficient mice. Proangiogenic growth factor containing alginate beads as surrogate for tumor xenografts were injected subcutaneously. Due to in vivo release of proangiogenic growth factors angiogenesis was induced into the alginate bead depots. Growing blood vessels could be detected with contrast enhanced micro- ultrasound. A significant difference in vascularization of growth factor containing and empty alginates could be quantified. Results were confirmed by a positive correlation of ultrasound contrast signal intensity and histological blood vessel density determined by using stereological tools. Aim of the second experiment was to observe the angiogenic process within individual alginate bead depots by micro-ultrasound. Similar to the first experiment growth factor containing or empty depots were injected subcutaneously in immunodeficient mice. The progressive vascularization of individual alginates was observed by micro-ultrasound. Early after study start a significant difference could be detected between growth factor containing and empty depots, which could be strongly confirmed by histology. The third study was carried out based on the results of study one and two. The progressing vascularization of growth factor containing and empty alginate bead depots was determined with contrast enhanced micro-ultrasound. Immunocompetent mice were used. Results showed no impact of immune status on ultrasound measurements of alginate bead depot angiogenesis. Finally, the established tumor surrogate angiogenesis model was used in a therapeutic experiment for the first time. Growth factor containing alginate bead depots were injected subcutaneously to immunocompetent mice. Mice were treated daily with Bevacizumab, an antiangiogenic anti-VEGF monoclonal antibody or with Regorafenib, an antiangiogenic oral multityrosine kinase inhibitor developed by Bayer Schering Pharma AG (BAY73-4506). Control groups were made up and treated with vehicles of Bevacizumab or Regorafenib. Micro-ultrasound measurements of individual alginate bead depot vascularization were conducted once weekly. Inhibition of angiogenesis due to treatment could be quantified in vivo early after study start. Significant differences between vehicle and drug treated groups were observed early. Correlation of micro-ultrasound and histological data showed a clear correlation of blood vessel profile density and contrast signal intensity. These results illustrate, that contrast enhanced micro-ultrasound is a fast, efficient and minimally invasively method for the quantitation of antiangiogenic effects in the tumor surrogate angiogenesis model. The tumor surrogate angiogenesis model was established in its modified form as a gentle in vivo model for a routinely testing of new antiangiogenic drugs. The tumor surrogate angiogenesis model combined with contrast enhanced micro-ultrasound has crucial advantages. First, the strong sensitivity regarding the in vivo quantitation of angiogenesis allows a highly precise in vivo assessment of antiangiogenic drug effects already at a very early phase after treatment start. Furthermore since this procedure can be used in vivo several times on the same animal, one can significantly minimize the number of study groups in the case of particular antiangiogenic questions, which, up to the present time, can only be answered by using many study groups. Finally, a reduction of mouse burden is given because the alginate bead depots are stable in their size during the whole experiment, are not able to metastasize or to become necrotic as often visible by using malignant tumors. The established tumor surrogate angiogenesis model in combination with contrast enhanced micro-ultrasound is well suited for pharmacological characterizations of new antiangiogenic drugs in biomedical research.