Evaluation of ileal digesta in weaning piglets fed different diets | Untersuchung ilealer Digesta von Absatzferkeln bei Fütterung mit verschiedenen Diäten

Deckblatt \- Impressum Persönlicher Dank Table of Contents Index of Tables Index of Figures List of Abbreviations Publication List 1 Introduction 1 2 Literature Review 4 3 Material and Methods 40 4 Results 67 4.1 Slaughter trial 67 4.2 Balance trial postweaning 84 4.3 Balance trial preweaning 90 4.4 Comparison of balance trials pre- and postweaning 91 5 Discussion 95 6 Summary 113 7 Zusammenfassung 116 8 References 120 9 Appendix 135 Acknowledgment Danksagung

The objective of our investigation was the evaluation of ileal digesta - qualitatively and quantitatively - in piglets before and after weaning, with special reference to protein and amino acid digestion. To implement this aim we conducted two main experimental complexes: a long-term slaughter trial for the qualitative aspects and two balance trials for the quantitative part. During the slaughter trial animals were sacrificed at different stages before and after weaning: -6, -4, -2 days preweaning, weaning day (28 d of age), +1, +2, +5, +8 and +15 days postweaning. Dietary regimes comprised sow milk as sole feed (no creep feed) before and after weaning four different starters, two reference diets based on soybean meal and whey and two home-produced diets based on cereals and legume seeds. Reference diets differed in supplementation of in-feed antibiotic avilamycin (+AB, -AB) and home-produced diets in crude fibre content, being either 3 or 8% (LF, HF). In the slaughter trial we applied a wide range of analysis, determining pH, DM, LA, VFA, NH3, biogenic amines and D-alanine and investigating the luminal microflora with classical and molecular techniques at ileal level. Although we observed changes in some parameters during weaning transition decrease in ammonia and VFA, increase in LA these scarcely proofed to be statistical significant. Also classical and molecular microbiology revealed a remarkable stability in the universal ileal microflora of piglets receiving sow milk or starter diets. Observed changes were more age-related than influenced by dietary treatment. Only the Lactobacillus spp. group displayed a differential response: here we could establish a diet-dependent change in the Lactobacillus spp. population. The home-produced diets induced a more diverse population than the reference diets, being more comparable to the Lactobacillus spp. population of suckling piglets. Lactic acid producing bacteria are regarded as health beneficial, especially in the GIT of young animals such as weaning piglets. Therefore the promotion of this group by the home-produced diets can be considered as a major benefit for intestinal health. However, more studies are required to receive statistical relevant evidence. Furthermore we detected a negative correlation between the Lactobacillus spp. group and yeast (Pearson Correlation Coefficient r = -0.24, p = 0.02) and a highly positive correlation to amines (putrescine = 0.41, p < 0.0001; histamine r = 0.36, p = 0.0005; cadaverine r = 0.35, r = 0.0006; spermidine r = 0.23, p = 0.03; spermine r = 0.28, p = 0.007). The inverse relationship with yeast was reported from Maribo et al., 2000, but evidence for biogenic amines in the porcine gut is rare in literature. There are some in vitro studies reporting production of biogenic amines in this bacterial species, but the main contribution to this field comes from food technology rather than from animal physiology research. These results suggest a crucial role of Lactobacillus spp. in the terminal ileum of weaning piglets. Further investigation is required to elucidate those interesting interrelationships in the GIT of farm animals, especially in swine. Balance trials were conducted with artificially reared piglets (milk replacer) to assess the preweaning quantitative aspects and postweaning with weaners fed the four starters already applied in the slaughter trial. The 15N tracer technique was used to estimate the endogenous nitrogen loss and the D-alanine method to assess the bacterial nitrogen contribution. Comprising the experiments of this study slaughter and balance trials - we could demonstrate that the small intestinal environment is subjected to a short- termed adaptation period during the actual weaning process. During this period the ileum adjusts to a physiological equilibrium, which goes along with minor changes in various parameters such as ammonia, VFA and LA. Postweaning our results showed no advantage of dietary supplementation with the in-feed antibiotic avilamycin compared with the other three starters. In fact we could demonstrate considerable beneficial characteristics of the home-produced low- fibre diet LF: higher nitrogen digestibility (apparent and real ileal N digestibility) as evidenced in the balance trial and a promotion of the Lactobacillus spp. population in the terminal ileum as showed in the slaughter trial. Both features might proof advantageous in the practical application of this diet: higher digestibility has the potential to improve ADG in long-term administration (exceeding 15 days postweaning), which is of great importance for commercial swine production in a financial aspect. Furthermore, enhancing the diversity of Lactobacillus spp. in the terminal ileum indicates that this cereal-based diet has probably prebiotic properties and therefore could be of good use in commercial swine production, particularly with regards to the EU- wide ban of antimicrobial feed additives in weaning piglets.The both balance trials aimed to investigate the nitrogen digestibility, endogenous and bacterial nitrogen at ileal in unweaned and weaned piglets fed different diets. The 15N tracer technique was applied to estimate endogenous nitrogen losses and calculate real ileal digestibility of nitrogen. Bacterial nitrogen was assessed by means of D-alanine as bacterial marker. Our results demonstrate that in unweaned piglets nitrogen digestibility was highest and endogenous and bacterial N flow (g/100g DMI resp. CPI) significantly lower compared to weaned pigs. Looking at total ileal N endogenous nitrogen contributed to the greatest and exogenous (dietary) nitrogen to the least part. This underlines the high nitrogen utilisation of milk replacer at the terminal ileum. Similar results were established for the low-fibre starter LF: real nitrogen digestibility was equal to that of milk replacer (98.5 ± 1.3 % vs. 98.2 ± 0.4 %) and endogenous nitrogen was the main contributor to total ileal N. The remaining starters +AB, -AB and HF showed markedly lower RIDN (90.2 ± 1.3, 88.3 ± 1.4, 94.0 ± 1.4 %). In the reference diets endogenous N was lower and exogenous N contribution greater than in home-produced starters and milk replacer. Bacterial nitrogen proofed to be less affected by weaning itself but influenced by dietary regime. Unweaned animals and those fed +AB and AB exhibited equal bacterial nitrogen contribution (11.6 ± 1.5, 11.4 ± 0.7, 11.8 ± 0.9 % of total N), whereas in piglets receiving LF and HF bacterial contribution was markedly lower (9.1 ± 0.8, 7.9 ± 0.8 % of total N). This might be attributed to differential microbial population, though these differences were not present in the results of the classical plate counting. One reason could be that the major part of the gastrointestinal microflora belongs to yet uncultured microorganisms, thus not to be proofed by classic microbiological techniques. However, D-alanine as bacterial marker can be assumed to have well covered the yet uncultured bacteria. D-alanine was used as a novel approach in swine. At present it is used successfully in ruminants, but not in monogastric animals. However, research of Schönhusen and Kwella (unpublished data) indicate its suitability as a bacterial marker in monogastric animals as well. Our results support this notion. Results obtained from both the balance trials imply that the magnitude of the main components of total ileal nitrogen endogenous and bacterial N are more dependent on the applied dietary regime, whether being milk replacer or starter diets, than on the actual weaning process. One crucial aspect of research, and especially in animal nutritional research, is to gain a wholesome picture of the physiological processes going on in the animal while it is subjected to such disturbing events like the weaning transition. In order to achieve such objective, we collaborated with various institutional partners in the frame- work of the EU-project Healthypigut . Besides the analysis and results we just demonstrated in this thesis we provided samples from these very piglets used in the outlined experiments to be investigated in different respects. Tissue sections from the small and large intestine of piglets from the slaughter trial were subjected to immunological and immuno-histological analysis (Medical School Hannover / Germany, group Hermann-Josef Rothkoetter). Digesta samples collected during the postweaning balance trial were provided for the analysis of mucine content (INRA Rennes / France, group Jean-Paul Lalles). Results of these investigations will be compiled and statistically analysed, thus providing the chance to integrate information about the same animal from different fields. Such approach is useful to obtain a wholesome image of the physiological state and its alterations during weaning and the linkage of digestive physiology, microbiology and immunology. Nevertheless more research is required to elucidate underlying mechanisms and develop suitable strategies for a gentle weaning process.

Das Ziel unserer Untersuchungen war die qualitative und quantitative Evaluierung ilealer Digesta bei Ferkeln vor und nach dem Absetzen, unter besonderer Berücksichtigung von Protein und Aminosäuren. Zur Verwirklichung dieser Zielstellung führten wir zwei Hauptversuchskomplexe durch: einen Schlachtversuch zur Untersuchung der qualitativen Aspekte und zur Quantifizierung Bilanzversuche vor und nach dem Absetzen. Zur qualitativen Charakterisierung der ilealen Digesta wurden Ferkel zu definierten Zeitpunkten; -6, -4, -2 vor dem Absetzen, Absatztag (28. Lebenstag) und +1, +2, +5, +8, +15 Tage nach dem Absetzen geschlachtet. Folgendes Fütterungsregime wurde von uns eingesetzt: vor dem Absetzen erhielten die Tiere ausschliesslich Sauenmilch (kein Beifutter) und nach dem Absetzen kamen vier verschiedene Starterdiäten zum Einsatz, zwei Referenzdäten (Soja-, Molke-, Getreidebasis) und zwei hofeigene Mischungen (Getreide-, Leguminosenbasis). Die Referenzdiäten unterschieden sich im Einsatz des Fütterungsantibiotikums Avilamycin (+AB, -AB) und die hofeigenen Mischungen in ihrem Rohfasergehalt, d.h. niedriger Rohfasergehalt mit 3 % (LF) und hoher Rohfasergehalt (HF) mit 8 %. Ein umfangreiche Auswahl an Analysen wurde an der im Schlachtversuch gewonnenen ilealen Digesta vorgenommen: pH-Wert, Trockensubstanz, Milchsäurekonzentration, Konzentration der flüchtigen Fettsäuren, NH3, amine, D-Alaninmethode, klassische und molekulare Mikrobiologie. Die so gewonnenen Ergebnisse wurden statistisch ausgewertet und obwohl in einigen Parametern Abfall von NH3 und FFS - Differenzen zwischen den einzelnen Diätgruppen festgestellt werden konnten, erwiesen sich diese selten als statistisch signifikant. Auch die Ergebnisse der klassischen und molekularen Mikrobiologie zeigten eine bemerkenswerte Stabilität der universellen Mirkoflora im Ileum von Saug- und Absatzferkeln. Die wenigen Veränderungen, die in unseren Untersuchungen festgestellt werden konnten, waren eher alters- als diätabhängig. Eine Ausnahme bildete die Gruppe der Milchsäurebakterien, Lactobacillus spp.: hier konnte ein Diäteinfluss auf die Population von Lactobacillus spp. festgestellt werden. Die hofeigenen Mischungen LF und HF induzierten eine größere Diversität in der Laktobazillen- Polulation als die Referenzdiäten, eher vergleichbar zu der Situation in Saugferkeln. Laktobazillen, die Hauptgruppe der M ilchsäurebakterien, werden als gesundheitsfördernd angesehen, insbesondere im Gastrointestinaltrakt junger Nutztiere, wie z.B. beim Ferkel. Ausgehend davon können wir schließen, dass die Förderung dieser Bakteriengruppe im Ileum von Absetzferkeln durch obengenannte Diäten als ein Hauptvorteil angesehen werden kann. Indes, mehr Untersuchungen zu diesem speziellen Punkt sind nötig, um dieses Ergebnis statistisch abzusichern. Weiterführende statistische Auswertung der gewonnenen Ergebnisse ergaben eine negative Korrelation zwischen Lactobacillus spp. und Hefen (Pearson s Korrelation Koefficient r = -0.24, p = 0.02) und stark positive Korrelationen zwischen Lactobacillus spp. und den Aminen (Putrescin = 0.41, p < 0.0001; Histamin r = 0.36, p = 0.0005; Cadaverin r = 0.35, r = 0.0006; Spermidin r = 0.23, p = 0.03; Spermin r = 0.28, p = 0.007). Das inverse Verhältnis zwischen Laktobazillen und Hefen wurde von Maribo und Kollegen (2000) berichtet, wohingegen Hinweise in der Literatur zum Verhältnis zwischen Laktobazillen und Aminen im Ileum kaum zu finden sind. Einige in vitro Untersuchungen konnten eine Aminproduktion dieser Bakterien zeigen, allerdings stammen diese Studien vorwiegend aus der Nahrungstechnologie denn aus der Tierphysiologie und ernährung. Die von uns gefundenen Ergebnisse weisen auf eine zentrale Rolle der Gruppe der Laktobazillen im terminalen Ileum von Absetzferkeln hin. Weiterführende Untersuchungen sind notwendig, um diese Beziehungen und Zusammenhänge im GIT von landwirtschaftlichen Nutztieren, insbesondere beim Schwein, näher zu beleuchten. Zur Untersuchung der quantitativen Aspekte führten wir 2 Bilanzversuche durch: vor dem Absetzen (mit Milchaustauscher aufgezogene Ferkel) und nach dem Absetzen (Absatzferkel vier Starterdiäten). Bei den angewendeten Startern handelte es sich um die bereits im Schlachtversuch zum Einsatz gekommenen Diäten. Um die endogenen Stickstoffverluste und damit die wahre N-Verdaulichkeit - zu bestimmen, wurde die 15N-Tracertechnik herangezogen und zur Beurteilung des bakteriellen Stickstoffanteils die D-Alaninmethode. Die zur Quantifizierung durchgeführten Verdaulichkeitsexperimente hatten die Untersuchung der N-Verdaulichkeit, der endogenen N-Verluste und des bakteriellen N-Anteils zum Ziel. Die 15N- Tracertechnik wurde angewendet, um endogene N-Verluste zu bestimmen und wahre N- Verdaulichkeiten zu berechnen. Der bakterielle N-Anteil wurde mittels D-Alaninmethode bestimmt. Unsere Ergebnisse zeigten, dass in Ferkeln vor dem Absetzen die wahre N-Verdaulichkeit am höchsten und der bakterielle N-Fluss (g/100g TS- bzw. RP-Aufnahme) signifikant niedriger war als bei Ferkeln nach dem Absetzen. Endogener N stellte den Hauptanteil des totalen ilealen N und Futter-N (exogener N) den niedrigsten Anteil. Dies unterstreicht die hohe N-Verwertung des verwendeten Milchaustauschers am terminalen Ileum. Überraschenderweise stellten sich die Ergebnisse für die hofeigene Diät LF ähnlich dar: wahre N-Verdaulichkeit unterschied sich nicht zum Milchaustauscher (98,5 ± 1,3 % vs. 98,2 ± 0.4 %) und endogener N stellte den Hauptanteil des totalen ilealen N. Dahingegen zeigten sich die Verdaulichkeiten der anderen Starter merklich niedriger (+AB: 90.2 ± 1.3, -AB: 88.3 ± 1.4, HF: 94.0 ± 1.4 %). Bei Ferkeln, die die Referenzdiäten erhielten, war der endogene N-Anteil signifikant niedriger und der exogene Anteil höher als bei Tieren mit hofeigenen Mischungen oder vor dem Absetzen. Der bakterielle Stickstoffanteil erwies sich weniger alters- denn diätabhängig. Ferkel vor dem Absetzen und Absatzferkel, die die Referenzdiäten erhielten, zeigten annähernd gleiche Werte für Bakterien-N im terminalen Ileum (11,6 ± 1,5, 11,4 ± 0,7, 11,8 ± 0,9 % N total), während die Werte für Tiere mit hofeigener Diät merklich niedriger waren (9,1 ± 0,8, 7,9 ± 0,8 % N total). Die klassisch Mikrobiologie spiegelt dieses Ergebnis nicht wieder. Als eine Ursache käme in Frage, das der Grossteil der gastrointestinalen Mikroflora zu den nicht-kultivierbaren Keimen gehört und daher mittels Plattenkultivierung nicht miterfasst werden konnte. Dessen ungeachtet ist es durchaus wahrscheinlich, dass D-Alanin als bakterieller Marker auch die nicht- kultivierbaren Keime miterfasst hat und es daher zu diesen Unterschieden kommen konnte. In unseren Untersuchungen wurde D-Alanin als verhältnismässig neuer bakterieller Marker beim Schwein eingesetzt. Bisher kam er fast ausschliesslich in der Wiederkäuerernährung erfolgreich zum Einsatz. Allerdings weisen Studien von Schönhusen und Kwella aus unserem Institut darauf hin, dass sein Einsatz bei Monogastriden ebenso nutz- wie sinnvoll ist. Unsere in diesem Rahmen gewonnenen Ergebnisse unterstützen diese Auffassung. Die im Verlauf der Verdaulichkeitsuntersuchungen erhobenen Daten implizieren, dass die Grösse der Hauptkomponenten von ilealem N total N endogen und N bakteriell eher vom angewandten Fütterungsregime als vom tatsächlichen Absetzprozess abhängt. All unsere Untersuchungen zusammenfassend, waren wir in der Lage zu demonstrieren, dass der Dünndarm und speziell das Ileum einer kurzfristigen Adaptationsperiode während des eigentlichen Absetzprozesses unterliegt. In dieser Zeit passt sich das Ileum den einflussnehmenden Veränderungen (soziale, diätetische und Umweltveränderungen) an, was mit geringfügigen Alterationen verschiedener Parameter wie FFS, MS, NH3 einhergeht. Eine anderes überraschendes Resultat unserer Untersuchungen war, dass die mit Avilamycin supplementierte Starterdiät +AB keinerlei Vorteile gegenüber den anderen Startern zeigte. Vielmehr konnten wir einige bemerkenswerte positive Effekte der hofeigenen Diät LF etablieren: signifikant höhere ileale N-Verdaulichkeit (scheinbar und wahr) und eine Förderung der Lactobacillus spp. Population im terminalen Ileum, wie aus Verdaulichkeits- und Schlachtversuch hervorgegangen ist. Beides könnte sich als vorteilhaft für die praktische Anwendung dieses Starters erweisen: höhere Verdaulichkeit kann potentiell zu verbesserten täglichen Zunahmen bei längerer Anwendung führen, was für die kommerzielle Schweineproduktion von immenser Bedeutung ist. Die Förderung der Laktobazillenpopulation im Ileum der Absetzer ist ein Indiz für prebiotische Wirkungsweise dieser Diät und ist insbesondere im Hinblick auf den EU-weiten Bann der Fütterungsantibiotika von Interesse. Ein besonderer Aspekt in der Wissenschaft und demzufolge nicht zuletzt in der Tierernährung, ist das Bemühen, ein so weit wie möglich komplettes Bild der physiologischen Prozesse im Organismus zu erhalten. Dies gilt besonders für solch herausragende Ereignisse wie das Absetzten. Um derart objektive, umfassende Ergebnisse zu erreichen, haben wir im Rahmen des EU-Projektes Healthypigut mit verschiedenen Forschungseinrichtungen zusammengearbeitet. Neben der Analyse und den daraus hervorgegangenen Ergebnisse, die im Rahmen dieser Dissertation präsentiert wurden, wurden weiterführende Untersuchungen der Proben unserer Versuchstiere vorgenommen. So waren z.B. Gewebeproben des Gastrointestinaltraktes der Ferkel des Schlachtversuches Gegenstand immunologischer und immune-histologischer Analysen an der Medizinischen Hochschule Hannover (Gruppe Hermann-Josef Rothkoetter). Weiterhin wurden Digestaproben der Verdaulichkeitsversuche auf ihren Muzingehalt untersucht (INRA Rennes / Frankreich, Gruppe Jean-Paul Lalles). Die dergestalt gewonnen Ergebnisse werden im Rahmen des EU-Projektes zusammengefasst und statistisch ausgewertet. Dies bietet eine gute Gelegenheit, die Daten aus diesen interdisziplinären Untersuchungen heranzuziehen und ein rundes Bild der physiologischen Vorgänge im Gastrointestinaltrakt zu erhalten. Indes, dies ist nur ein erster Schritt und weiterführende Untersuchungen und Kollaborationen unterschiedlichster Fachgebiete sind notwendig, um sinnvolle Strategien für einen sanften und stressreduzierten Absetzprozess zu entwickeln.