Multifunctional entomopathogenic ascomycetes for "cotton leafworm" Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) control in cucurbits | Ascomicetos entomopatógenos multifuncionales para el control de la “rosquilla negra” Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae) en cucurbitáceas

Durante el siglo XXI se ha acelerado el crecimiento de la población mundial, que superará los nueve mil millones en 2050, lo que plantea importantes desafı́os para la agricultura en términos de seguridad e inocuidad alimentaria, en un contexto donde se ha incrementado la preocupación social y la presión regulatoria por los efectos negativos sobre el medio ambiente y los seres vivos de los insecticidas quı́micos de sı́ntesis, de los que aun depende la reducción de las pérdidas de cosecha debidas a la acción de las plagas agrı́colas. Ası́, la búsqueda de alternativas no quı́micas de control de plagas se ha convertido en un pilar de las polı́ticas agrarias a nivel mundial, y muy en especial, en el contexto europeo, como refleja la controvertida Agenda 2030. Dentro de estas alternativas, el control microbiano de plagas por medio de ascomicetos entomopatógenos (AE), en especial especies de los géneros Beauveria sp. y Metarhizium sp., que tienen modo de acción por contacto, ha suscitado un interés creciente, no só lo por su virulencia, sino también por su carácter de microorganismos multifunción en agricultura, con asociaciones con las plantas como endófitos, epı́fitos o competentes en la rizosfera, de las que pueden derivarse nuevas estrategias sostenibles de protección y producción vegetal. Como resultado de estas interacciones, los AE proporcionan a la planta protección sistémica frente a estreses bióticos y abióticos por mecanismos directos e indirectos, estos últimos aún poco conocidos, pero asociados en muchos casos a reguladores comunes como el etileno (ET), vinculando respuestas a factores como la deficiencia de hierro y la Resistencia Sistémica Inducida (RSI). De hecho, estudios recientes ponen de manifiesto la multifuncionalidad de los AE, en particular las especies Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Hypocreales: Cordycipitaceae) y Metarhizium brunneum Petch (Hypocreales: Clavicipitaceae), que no solo regulan numerosas relaciones multitróficas cultivo-insecto-fitó fago-enemigo natural en distintos agroecosisemas, sino que además tienen un impacto positivo sobre la adquisición de nutrientes y sobre el crecimiento y la productividad de cultivos de importancia económica. En este contexto, la presente tesis doctoral ha abordado un sistema multitrófico donde cepas endófitas de las dos especies de AE mencionadas se han utilizado para el control de la plaga polı́faga Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae), junto con el parasitoide koinbionte solitario Hyposoter didymator (Thunberg) (Hymenoptera: Ichneumonidae), en cultivo de melón, con atención no solo a la compatibilidad directa de los agentes de control biológico, sino al impacto de los AE sobre el crecimiento del cultivo y el efecto indirecto sobre el fitófago. El Capı́tulo II aborda el tipo de respuesta de plantas de meló n inoculadas con AE al ataque de S. littoralis, ası́ como los mecanismos moleculares que la regulan. Las plantas de melón se inocularon con tres cepas de AE, cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum y cepas EABb 04/01-Tip y EABb 01/33-Su de B. bassiana, mediante tratamiento de suelo, tratamiento de semilla y tratamiento foliar. Se evaluaron dos escenarios de infestación con larvas de S. littoralis, infestación secuencial de duración corta, ası́ como infestación permanente. Las plantas inoculadas mostraron antibiosis frente al nóctuido (efectos letales y subletales), ası́ como una compensación del crecimiento o tolerancia en respuesta a diversos escenarios de infestación de este. Se registró un aumento en el peso fresco y seco de la planta, contenido de clorofila, número de ramas secundarias y diámetro del tallo, al tiempo que inducı́a efectos subletales en S. littoralis. Además, se observó una sobreexpresión relativa de los genes relacionados con el ET (ACO1, ACO3, EIN2, EIN3) y el ácido jasmónico (AJ) (LOX2), siendo mayor la inducción de los genes relacionados con ET y AJ, por la presencia endofı́tica de B. bassiana, especialmente en plantas infestadas con S. littoralis. Estos resultados no solo confirman la multifuncionalidad de los AE, sino su implicación tanto en la inducción del sistema defensivo del melón, que se refleja no solo en la antibiosis frente al lepidóptero fitófago, sino también en un crecimiento compensatorio o tolerancia del cultivo al ataque del insecto. Bajo la premisa de que los AE son microorganismos multifuncionales, el Capı́tulo III revela los mecanismos moleculares mediante los cuales estos ascomicetos brindan protecció n a través de respuestas de resistencia sistémica contra insectos fitó fagos. En este trabajo, se aplicó un priming en las raı́ces de plántulas de cucurbitáceas, pepino y meló n, con la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum, y se estudió la expresió n relativa de 18 genes relacionados con la sı́ntesis de ET, AJ y ácido salicı́lico (AS), ası́ como genes de proteı́nas relacionadas con patogénesis (PR) mediante qRT-PCR. Los efectos del priming en S. littoralis se estudiaron al exponer larvas del nó ctuido a plantas que habı́an recibido un priming con el AE o bien plantas del testigo durante 15 dı́as. Se observó la complejidad y el grado de solapamiento entre las rutas reguladoras, y aunque existió una sobreexpresión general de todos los genes estudiados en plantas con priming por AE, destacaron EIN2 y EIN3, genes clave en la vı́a de transducción de ET, que aumentaron sus niveles de expresión hasta ocho y cuatro veces, respectivamente. Además, los genes de sı́ntesis de AJ, AS y PR mostraron una sobreexpresión significativa durante el perı́odo de observación (por ejemplo, LOX1, gen implicado en la sı́ntesis de AJ, aumentó 506 veces). Se observó una mortalidad significativa de las larvas de S. littoralis alimentadas con plantas tratadas (con priming fúngico) en comparación con las plantas testigo, además de un efecto negativo del priming fúngico sobre el fitness del lepidóptero revelado por la duración de los estadı́os larvarios, peso de pupas y porcentaje de pupas anormales, lo que pone de manifiesto el efecto beneficioso de la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum sobre la inducción de resistencia en cucurbitáceas. La alta inducción de genes relacionados con la sı́ntesis y señalización de ET detectada en este capı́tulo, que es un regulador común entre la RSI y la deficiencia de Fe, impulsó la investigación llevada a cabo en el Capı́tulo IV, en el que se investiga el efecto de las cepas de AE sobre la adquisición del hierro (Fe), tanto in vitro en cuanto a la exudación de sideróforos, como in vivo en lo que se refiere al contenido de Fe en plantas de melón y pepino, para las tres cepas de B. bassiana y M. bruneum. La cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum mostró una gran capacidad para producir sideróforos de hierro revelada por hasta un 58.4% de cambio en la coloración del medio (de azul a naranja) por acción de la exudación de sideróforos, porcentaje que alcanzó el 24.3% y 17.8% para las cepas EABb 04/01-Tip y EABb 01/33-Su de B. bassiana, respectivamente. Asimismo, la cepa EAMa 01/58-Su proporcionó un mayor contenido de Fe tanto en materia seca como en el sustrato en comparación con el control, por lo que fue seleccionada para dilucidar la posible inducción de respuestas de deficiencia de Fe, que incluyen la Actividad de la Reductasa Férrica (ARF), y la expresión relativa de genes de adquisición de Fe mediante qRT-PCR en plantas de melón y pepino. El priming de raı́ces con la cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum provocó respuestas a la deficiencia de Fe a nivel transcripcional, con una regulación positiva temprana (24, 48 o 72 h después de la inoculación) de los genes de adquisición de Fe como FRO1, FRO2, IRT1, HA1 y FIT, ası́ como de la ARF. Estos resultados destacan los mecanismos involucrados en la adquisición de Fe mediada por la cepa EAMa 01/58- Su de M. brunneum. Finalmente, en el Capı́tulo V, el parasitoide H. didymator fue evaluado contra S. littoralis en un sistema multitrófico en invernadero con plantas de melón colonizadas endofı́ticamente por tres cepas de AE, cepa EAMa 01/58-Su de M. brunneum y cepas EABb 04/01-Tip y EABb 01/33-Su de B. bassiana. En un primer escenario, se utilizaron tres métodos de aplicación para inocular las plantas de melón con los AE, tratamiento de suelo, tratamiento de semilla y tratamiento foliar, y tras su infestación con larvas de S. littoralis, se liberó el parasitoide en una proporción de 1:20. Los métodos de detección microbiológica y molecular permitieron detectar la colonización progresiva a lo largo de todo el ciclo fenológico del cultivo, e incluso para B. bassiana, alrededor del 20% de las semillas de nuevos frutos estaban colonizadas. Se demostró que el parasitoide es compatible con todas las cepas y métodos de aplicación, con tasas de mortalidad totales que oscilaban entre el 11.1% (EAMa 01/58-Su en inoculación por recubrimiento de semilla) y el 77.8% (EAMa 01/58-Su en inoculación por pulverización foliar). Además, para diferentes combinaciones de cepa y método de aplicación, se observó una disminución del peso de pupas, mortalidad pupal (tanto normales como con deformidades), ası́ como una extensión de los tiempos de desarrollo larvario y pupal. Asimismo, los tratamientos con AE mejoraron el crecimiento del cultivo de melón, con un incremento significativo del peso de raı́ces, partes aéreas (hojas y tallos) y peso total de planta. En un segundo escenario, las plantas fueron inoculadas con estas cepas, mediante pulverización localizada de dos hojas basales, y después de ser infestadas con larvas del nóctuido, se liberó el parasitoide en una proporción de 1:10, lo que permitió revelar la traslocación del AE, ası́ como su compatibilidad con el parasitoide. Estos hallazgos destacan el uso compatible de un parasitoide con cepas de AE multifuncionales, que permiten el control de S. littoralis, con impacto positivo sobre el cultivo de melón.

During the 21st century, the world population growth has accelerated and it is expected to exceed 9 billion by 2050, which poses important challenges for agriculture in terms of food safety and security, in a context where social concern and regulatory pressure have increased due to risks to human health and to the environment of chemical insecticides, on which reduction of crop losses due to the action of agricultural pests still mostly depends. Thus, the search for non-chemical alternatives for pest control has become a pillar of agricultural policies worldwide, and especially in the European context, as reflected in the controversial Agenda 2030. Within these alternatives, microbial pest control by means of entomopathogenic ascomycetes (EA), especially species of the genera Beauveria sp. and Metarhizium sp., which have contact mode of action, has attracted increasing interest, not only for their virulence, but also for their multifunctionality in agriculture, with associations with plants as endophytes, epiphytes or competent in the rhizosphere, from which new sustainable strategies for plant protection and production can be derived. As a result of these interactions, EA provide the plant with systemic protection against biotic and abiotic stresses by direct and indirect mechanisms, the latter still poorly understood, but in many cases associated with common regulators such as ethylene (ET), linking responses to factors such as iron deficiency and Induced Systemic Resistance (ISR). Moreover, recent studies highlight the multifunctionality of EA, in particular the species Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin (Hypocreales: Cordycipitaceae) and Metarhizium brunneum Petch (Hypocreales: Clavicipitaceae) that not only regulate numerous multitrophic interactions crop-insect pest-natural enemy, but also h ave a positive impact on nutrient acquisition and on the growth and productivity of economically important crops. In this context, the present PhD thesis has addressed a multitrophic system where endophytic strains of the two mentioned EA species have been used for the control of the polyphagous pest Spodoptera littoralis (Boisduval) (Lepidoptera: Noctuidae), together with the solitary koinbiont parasitoid Hyposoter didymator (Thunberg) (Hymenoptera: Ichneumonidae), in melon crop, with attention not only on the direct compatibility of the biological control agents, but on the impact of the EA strains on crop growth and the indirect impact on the noctuid pest. Chapter II addresses the type of response of melon plants inoculated with AE to S. littoralis attack, antibiosis and/or tolerance, as well as the molecular mechanisms regulating it. Two scenarios of infestation with S. littoralis larvae were evaluated: shortterm sequential infestation and long-term infestation. Molecular techniques were used to study progressive endophytic colonization and the relative expression of plant defense genes. The inoculated plants showed antibiosis (lethal and sublethal effects) and growth compensation in response to different S. littoralis infestation scenarios. An increase in fresh and dry weight, chlorophyll content, number of secondary branches, and stem diameter was recorded, while causing sublethal effects in S. littoralis. In addition, up-regulation in the relative expression of ET (ACO1, ACO3, EIN2, EIN3) and jasmonic acid (JA) (LOX2)-related genes was observed, with higher induction of genes related to ET and JA, due the endophytism by B. bassiana, specially in S. littoralis infested plants. These results strongly confirm the EA multifunctionality and the involvement of the endophytic EA triggered melon defensive system induction in the antibiosis and compensatory growth to protect melon plants from pest damage. Under the premise that EA are multifunctional microorganisms, Chapter III reveals the molecular mechanisms by which these EA provide protection through systemic resistance responses against phytophagous insects. In this work, the roots of cucurbits seedlings were primed with M. brunneum (EAMa 01/58-Su strain), and the relative expression of 18 genes related to ET, JA and salicylic acid (SA) synthesis, as well as pathogen related (PR) protein genes were studied by qRT-PCR. Effects of priming on S. littoralis were studied by feeding larvae for 15 days with primed and control plants. The complexity and degree of overlap between regulatory pathways was observed, and although there was a general overexpression of all genes studied in plants primed by AE, it was particularly important for EIN2 and EIN3 genes that are key in the ET transduction pathway, which increased their expression levels up to eightfold and fourfold, respectively. Also, genes related to JA, SA synthesis and PR showed significant up-regulation during the observation period (e.g. the JA gen LOX1, increased 506 times). Survivorship and fitness of S. littoralis were affected with significant effects on mortality of larvae fed on primed plants vs. controls. In addition, the length of the larval stage, the weight of the pupa, and the percentage of abnormal pupae were significantly affected. These results highlight the role of EAMa 01/58-Su strain in the induction of resistance, which would be translated into direct benefits for plant development. As this chapter reveals that plants primed with M. brunneum EAMa 01/58-Su strain show high induction of genes related to ET synthesis and signaling, which is a common regulator between ISR and Fe deficiency, Chapter IV aims to investigate the effect of EA strains on iron (Fe) acquisition, both in vitro in terms of siderophore exudation and in vivo regarding Fe content in melon and cucumber plants, for the three strains of B. bassiana and M. bruneum. The M. brunneum EAMa 01/58-Su strain was revealed as a high iron siderophore producer, with a 58.4% change in the color of the medium (from blue to orange) due to the siderophores exudation, followed by the strains EABb 04/01- Tip and EABb 01/33-Su of B. bassiana, with exuded surface of 24.3% and 17.8%, respectively. Likewise, the M. brunneum EAMa 01/58-Su strain provided higher Fe content in both dry matter and substrate compared to the control, therefore, it was selected to elucidate the possible induction of Fe deficiency responses, including Ferric Reductase Activity (FRA), and the relative expression of Fe acquisition genes by qRTPCR in melon and cucumber plants primed by root immersion. Root priming by M. brunneum EAMa 01/58-Su strain elicited Fe deficiency responses at the transcriptional level. Our results show an early up-regulation (24, 48 or 72 h post-inoculation) of the Fe acquisition genes FRO1, FRO2, IRT1, HA1, and FIT as well as an increase of the FRA. These results highlight the mechanisms involved in the Fe acquisition mediated by M. brunneum EAMa 01/58-Su strain. Finally, Chapter II addresses, under greenhouse conditions, the control of S. littoralis with the parasitoid H. didymator in a multitrophic system with melon plants endophytically colonized by the three strains of AE, strain EAMa 01/58-Su of M. brunneum and EABb 04/01-Tip and EABb 01/33-Su of B. bassiana. In a first scenario, three application methods were used to inoculate melon plants: soil drenching, seed coating or entire plant spraying. After being infested with S. littoralis larvae, the parasitoid was released in a ratio of 1:20. Microbiological and molecular detection allowed detecting progressive colonization throughout the plant life cycle, and for B. bassiana, even about 20% of the seeds of new fruits were colonized. The parasitoid was shown to be compatible with all strains and application methods, with total mortality rates ranging from 11.1% (EAMa 01/58-Su in seed coating inoculation) to 77.8% (EAMa 01/58-Su in leaves spraying inoculation). In addition, significant sublethal effects were recorded, such as a decrease in the weight of pupae, increased pupal mortality (both normal and with deformities), as well as an extension of the larval and pupal development times detected for different combinations of strain and application method. Likewise, EA treatments improved the growth of the melon crop, as revealed by the significant increases in root weight, aerial parts (leaves and stems) and total plant weight. In a second scenario, the plants were inoculated with the three EA strains by spraying only the two basal leaves, and after being infested with noctuid larvae, the parasitoid was released in a ratio of 1:10, which allowed to reveal the translocation of the fungus from the inoculation point and to confirm the compatibility of the parasitoid-EA-based strategy. These findings highlight the compatible use of a parasitoid with EA for the control of S. littoralis, which can also take advantage of its multifunctionality for the sustainable production of melon crop.