Characterization of antiviral activity of green tea extract and applications for improving food safety

Norovirus, hepatitis A virus (HAV) and more recently hepatitis E virus (HEV) are some of the main health risks associated with food consumption having a high impact on food safety and being responsible for diverse pathologies in consumers (from moderate gastroenteritis to more serious pathologies such as hepatitis or even meningitis or encephalitis). Because enteric viruses are mainly transmitted by the faecal-oral route, their presence can occur in food which has been directly contaminated with faecal material or contaminated water. The main foodstuffs involved in foodborne infections are mollusc bivalves, vegetables and salads, berries, and ready-to-eat food which have been contaminated by improper handling after their preparation or cooking. As a consequence of the increasing number of foodborne outbreaks, international organisms, such as the World Health Organization (WHO) or the European Food Safety Authority (EFSA), propose studies on the efficacy of food processes for virus inactivation. Moreover, the WHO is promoting the development of alternative methods for the decontamination of food. To this end, the present doctoral thesis has focused on the effect of green tea extract (GTE) against human enteric viruses and its potential application in food products or food contact surfaces to enhance food safety. Initially, the antiviral activity and characterization of GTE was evaluated on murine norovirus (MNV), a human norovirus surrogate, and HAV with different temperatures, exposure times and pH conditions showing effectiveness against both viruses depending on pH with higher reductions observed in alkaline and neutral conditions. At the same time, different concentrations of GTE (0.5 and 5 mg/mL) were mixed with viral suspensions and incubated for 2 or 16h (overnight) at 4, 25 and 37°C. Complete viral inactivation was achieved after overnight exposure at 37°C for both viruses and also at 25°C for HAV. In following assays, it was observed that GTE enhanced its antiviral activity when the GTE solution was prepared 24h before its application (aged-GTE). Additional HPLC/MS analyses demonstrated that the enhanced antiviral activity was related to changes in the chemical composition resulting from the formation of catechin derivatives during storage, mainly epigallocatechin gallate (EGCG) that accounted for around 40-50% of GTE composition. Furthermore, norovirus inactivation by GTE was assessed indirectly by testing the effect of aged-GTE on virus-like particles (VLPs) of human norovirus by a porcine gastric mucine (PGM) binding ELISA and transmission electron microscopy (TEM), and on human norovirus suspensions by an in situ capture-RT-qPCR method. Viability RT-qPCR was also evaluated by treating norovirus with EGCG in combination with PMAxx as intercalating dye. Results displayed a significant reduction of close to 50% in the binding to PGM. However, results from viability RT-qPCR indicated that EGCG did not dramatically affect the viral capsid. With the aim to apply GTE to enhance food safety, the potential application of aged-GTE was evaluated in different scenarios. Firstly, the stability of GTE was evaluated in simulated gastric conditions (salivary, gastric and intestinal) to shed light on its capacity as a therapeutical antiviral compound to fight enteric viruses inside the organism. MNV titers decreased to undetectable levels while HAV infectivity reduced by 2 log. Moreover, aged-GTE was incorporated into different contaminated beverages (orange and apple juice, horchata and milk). Results showed a reduction of infectious titers to undetectable limits for MNV in apple juice, while the best HAV reductions were reported in apple juice with a more than 2 log decrease when treated at 5 mg/mL of aged-GTE at 37⁰C for 16 hours. When food models were exposed to moderate heat treatments combined with aged-GTE, increased MNV inactivation was reported. Nevertheless, no such synergistic effect was observed for HAV. Subsequent assays were on track to elucidate the antiviral behaviour of GTE as natural sanitizers for food contact surfaces and washing solution for vegetables. Based on the ISO 13697:2001 standard, suspensions of MNV and HAV were spotted and dried on stainless steel and glass food contact surfaces. Then, aged-GTE was pipetted above the viral inoculums for 15 and 30 min and finally recovered. A similar methodology was performed in the sanitation tests for fresh lettuce and spinach leaves. Results reported a 1.5 log reduction and complete inactivation was observed for MNV and HAV on stainless steel and glass surfaces that had been treated with 10 mg/mL of GTE for 30 min. In lettuce and spinach, MNV and HAV titers were reduced by more than 1.5 log after a 30 min treatment. Finally, GTE was incorporated into edible coatings with the goal of controlling virus contamination in berries. The addition of aged-GTE to carrageenan and alginate/oleic matrices applied on blueberries and raspberries improved the antiviral activity at both refrigerated and ambient temperatures, being slightly more effective in the case of MNV. Lastly, supported by the results of the present thesis, it can be concluding that GTE is a natural and inexpensive option to improve viral food safety.

Los norovirus, el virus de la hepatitis A y el virus de la hepatitis E son algunos de los principales riesgos sanitarios relacionados con el consumo de alimentos teniendo un alto impacto en la seguridad alimentaria y siendo responsables de diversas patologías en los consumidores (desde gastroenteritis leves hasta patologías de carácter serio como pueden ser hepatitis o incluso meningitis o encefalitis). Debido a que los virus entéricos se transmiten principalmente por la vía fecal-oral, su presencia puede darse en alimentos que se hayan contaminado de forma directa con material fecal o mediante agua contaminada. Los alimentos mayoritariamente implicados en este tipo de infecciones son los moluscos bivalvos, vegetales y ensaladas, bayas y productos listos para consumir los cuales se han contaminados por una incorrecta manipulación después de su preparación o cocinado. Como consecuencia del incremento de brotes de transmisión alimentaria, organismos internacionales como la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Autoridad Sanitaria de Seguridad Alimentaria (EFSA), proponen evaluar la eficacia de procesos alimentarios para la inactivación de virus. Además, la OMS está promoviendo el desarrollo de métodos alternativos para la descontaminación de alimentos. Con esta finalidad, la presente tesis doctoral se ha centrado en el efecto del extracto de té verde (GTE) frente a virus entéricos humanos y su uso en alimentos o en superficies de contacto alimentario con el fin de mejorar la seguridad alimentaria. Inicialmente, la actividad virucida y la caracterización del GTE se evaluó frente al norovirus murino (MNV), un virus modelo de los norovirus humanos, y el HAV a diferentes temperaturas, tiempos de contacto y condiciones de pH, mostrando efectividad frente a estos dos virus en función del pH y observándose mayores reducciones en condiciones alcalinas y neutras. Al mismo tiempo, diferentes concentraciones del GTE (0,5 y 5 mg/mL) se mezclaron a partes iguales con la suspensión viral y fueron incubadas durante 2 y 16 horas a 4, 25 y 37°C. Los resultados mostraron la completa inactivación de ambos virus después de tratamientos a 37°C durante 16 horas y a 25ºC para el HAV. En posteriores ensayos se observó que el GTE mejoraba su actividad cuando se preparaba 24 horas antes de su aplicación (aged-GTE). Por otro lado, los análisis mediante HPLC/MS demostraron que la mejora de la actividad antiviral estaba relacionada con los cambios en la composición química del GTE debido a la formación de catequinas que se producía durante el periodo de 24 horas, principalmente a la epigalocatequina galato (EGCG) suponiendo alrededor de un 40-50% de la composición del GTE. Por otra parte, el efecto del GTE sobre norovirus humanos fue evaluado indirectamente mediante partículas pseudovíricas (VLPs) y ensayos con mucina gástrica porcina (PGM) unida a la técnica ELISA y microscopía electrónica de transmisión además de analizar dicho efecto en suspensiones de norovirus humanos por la técnica in situ capture-RT-qPCR. Además, se realizaron ensayos de viabilidad por RT-qPCR tratando suspensiones de norovirus con EGCG combinadas con PMAxx como agente intercalante. Los resultados obtenidos mostraron reducciones cercanas al 50% en la capacidad de unión a la PGM. Sin embargo, los resultados de PCR de viabilidad indicaron que el tratamiento con ECGC no afecta a la cápside viral de manera considerable. Con el objetivo de utilizar el GTE para mejorar la seguridad alimentaria, en el marco de esta tesis se evaluó su uso en diversas aplicaciones alimentarias. Inicialmente, se evaluó la estabilidad del GTE en condiciones gástricas simuladas (saliva, gástrica e intestinal) para dilucidar su eficacia como compuesto antiviral terapéutico frente a virus entéricos después de la ingesta. Estos ensayos demostraron que los niveles de MNV se redujeron por debajo del límite de detección mientras que los del HAV se redujeron en 2 órdenes logarítmicos. Además, el GTE fue incorporado a diferentes bebidas (zumos de naranja y manzana, horchata y leche) que se trataron con GTE XXX. Los resultados mostraron reducciones por debajo del límite de detección para MNV en zumo de manzana, mientras que para el HAV los mejores resultados se obtuvieron en zumo de manzana, con más de 2 ordenes logarítmicos de reducción cuando se trató con GTE a 5 mg/mL durante 16 horas a 37⁰C. Cuando las bebidas se trataron mediante tratamientos térmicos moderados combinados con la adición de GTE se observó un aumento de la inactivación del MNV. En cambio, este efecto sinérgico no se observó para el HAV. Posteriormente se evaluó el GTE como higienizante natural para la desinfección de superficies de contacto alimentario y vegetales. Estos ensayos se realizaron según la norma ISO 13697:2001, inoculando suspensiones de MNV y HAV sobre superficies de acero inoxidable y vidrio y añadiendo posteriormente la solución de GTE que se dejó actuar durante de 15 y 30 minutos. Una metodología similar se llevó acabo en ensayos de desinfección en hojas de lechuga y espinacas frescas. Los resultados obtenidos mostraron reducciones de 1,5 órdenes logarítmicos e inactivación total para MNV y HAV en acero inoxidable y vidrio tratados con GTE (10 mg/mL), respectivamente. Resultados similares se obtuvieron en los tratamientos de lechuga y espinacas bajo las mismas condiciones experimentales. Por último, el GTE fue incorporado a recubrimientos comestibles con el objetivo de minimizar la contaminación de virus en frutos tipo baya. La adición se efectuó a matrices de alginato/oleico y diferentes carragenatos aplicándose sobre arándanos y frambuesas resultando en la mejora de la actividad antiviral tanto a temperatura ambiente como de refrigeración, siendo algo más efectivo para MNV. Finalmente, en base a los resultados de la presente tesis, se puede concluir que el GTE es una opción natural y de bajo coste para la mejora de la seguridad alimentaria frente a virus entéricos.