Putative sorting signals involved in PIN1 trafficking

Las auxinas son hormonas vegetales involucradas en muchos procesos fisiológicos, tales como el crecimiento y diferenciación celular, la maduración de los frutos, la floración o los tropismos. Su transporte a través de la planta es polar, jugando un papel esencial en la regulación del crecimiento y el desarrollo y contribuyendo al mantenimiento de la polaridad global de la planta. La polaridad en el flujo de auxinas es debida, al menos en parte, a la distribución polar de los transportadores de salida de auxina de la familia PIN. En Arabidopsis thaliana se han identificado 8 transportadores PIN diferentes. Todos ellos presentan una estructura similar, con un dominio citosólico central que separa dos dominios hidrofóbicos con alrededor de 5 regiones transmembrana cada uno. Mientras los dominios hidrofóbicos de estas proteínas están muy conservados, el dominio citosólico central varía. En este sentido, las proteínas PIN se pueden agrupar en 2 subfamilias: tipo 1 o “PIN largos” (PIN1, PIN2, PIN3, PIN4 y PIN7) que se caracterizan por un dominio citosólico largo y una localización en la membrana plasmática y tipo 2 o “PIN cortos”, en los que se agrupan PIN5, PIN6 y PIN8, localizados en el retículo endoplásmico y con un dominio citosólico corto (PIN6) o extremadamente reducido (PIN5 y PIN8) (Křeček et al., 2009; Mravec, 2009; Zažímalová et al., 2010). La localización de los transportadores PIN de tipo 1 varía dependiendo del tipo celular (Vieten et al., 2007). En concreto, en la raíz principal de A. thaliana, las proteínas PIN presentan diferentes tipos de localización, encontrándose la mayoría de ellas en la parte basal de las células, ya sea de las células de la estela o de la vasculatura, como es el caso de PIN1, PIN3 y PIN7 (también con una localización no polar en las células de la columela) o en la parte basal de las células corticales, como PIN2, mientras que algunas se localizan también apicalmente, como PIN1 en la epidermis del tallo o PIN2 en el ápice de las raíces laterales y en las células de la epidermis. Por tanto, las proteínas PIN presentan una distribución polar dentro de la célula (Feraru & Friml, 2008), la cual depende de su tráfico vesicular, en concreto de su transporte bidireccional entre la membrana plasmática y compartimentos endosomales. Específicamente, se ha demostrado que la endocitosis de PIN1 es dependiente de clatrina y que es inhibida por auxinas, mientras que su reciclaje es dependiente de GNOM y está inhibido por brefeldina A (BFA). Sin embargo, aún se desconocen las señales de clasificación que permiten la inclusión de los transportadores PIN en diferentes tipos de vesículas recubiertas para su tráfico intracelular. Estas señales, compuestas en su mayoría por péptidos muy cortos de 4 a 6 aminoácidos, suelen localizarse en los dominios citosólicos de las proteínas de membrana, e interaccionan con las proteínas responsables de su clasificación en vesículas. El objetivo de este trabajo ha sido investigar los mecanismos moleculares que determinan la polaridad de PIN1, tratando de identificar las señales de clasificación presentes en su dominio citosólico que pueden determinar su localización polar, incluyendo su transporte desde el retículo endoplásmico (ER) a la membrana plasmática, su internalización desde la membrana plasmática a compartimentos endosomales o su tráfico entre los endosomas y dominios específicos de la membrana plasmática. Previamente se había demostrado que la endocitosis de PIN1 es dependiente de clatrina, pero además de ésta, existen otras rutas de transporte en las que también participan vesículas recubiertas de clatrina, y que podrían contribuir a la polaridad de PIN1. Por ello, este trabajo se ha enfocado en el estudio de las vías dependientes de clatrina. Además, el dominio citosólico de PIN1 contiene varias señales consenso para la unión de complejos adaptadores (como motivos YxxØ) y por lo tanto para su incorporación en vesículas recubiertas de clatrina, que podrían ser esenciales para la localización y el tráfico de PIN1. En particular, el dominio citosólico de PIN1 posee 4 residuos de tirosina (Y260, Y328, Y394, Y480) y un residuo de fenilalanina (F165) que podrían estar implicados en la inclusión de PIN1 en vesículas recubiertas de clatrina. Por tanto, se estudió la funcionalidad de diferentes versiones mutantes de PIN1 en dichos residuos, expresándolas en Arabidopsis thaliana, tanto en fondo wild type como en fondo pin1. Una vez obtenidas las diferentes líneas transgénicas, se analizaron la localización y el tráfico de estas versiones mutantes, para poder investigar si las posibles señales de clasificación afectadas contribuían o no al tráfico y localización de PIN1. Para este fin, en primer lugar, se obtuvieron líneas transgénicas de Arabidopsis thaliana que expresan diferentes versiones mutantes de PIN1:GFP en los residuos que forman parte de posibles señales de clasificación, tanto en fondo wild type como en fondo pin1. El análisis de recuperación de fenotipo indicó que PIN1:GFP-Y260A y PIN1:GFP-Y328A fueron capaces de recuperar el fenotipo pin1, igual que PIN1:GFP. En cambio, para que PIN1:GFP-Y394 recuperara el fenotipo pin1 fueron necesarios niveles de expresión muy elevados. PIN1:GFP-F165A no fue capaz de recuperar por completo el fenotipo pin1 en ninguna de las líneas examinadas, al igual que en los casos donde PIN1:GFP-Y480A era altamente expresado. Estos resultados sugieren que los residuos F165, Y394 e Y480, que forman parte de posibles señales de clasificación presentes en el dominio citoplasmático de PIN1, podrían ser importantes para la función de la proteína. Posteriormente se analizó la localización subcelular y el tráfico de las distintas versiones mutantes de PIN1:GFP. La localización subcelular de PIN1:GFP-Y260A, Y328A e Y394A era prácticamente idéntica a la de PIN1:GFP en células de la estela en raíces de A. thaliana. Para testar si estos mutantes presentaban alguna alteración en su endocitosis y/o reciclaje desde los endosomas, se utilizó un tratamiento con brefeldina A (BFA), que inhibe el reciclaje y produce la acumulación de PIN1 en compartimentos endosomales, junto con membranas del Golgi (compartimentos de BFA). Este tratamiento, por tanto, permite monitorizar la cinética de endocitosis (aparición de PIN1 en compartimentos de BFA). Puesto que el efecto de la BFA es reversible, tras el lavado de la droga, PIN1 reaparece en la membrana plasmática, lo que permite medir la cinética de reciclaje. Ninguno de estos 3 mutantes presentó defectos obvios en su endocitosis o reciclaje. Esto sugiere que los residuos Y260A, Y328A e Y394A no son esenciales para la localización subcelular de PIN1 en la parte basal de la membrana plasmática en raíces. En cambio, PIN1:GFP-F165A y PIN1:GFP-Y480A se localizaron mayoritariamente en grandes puntos intracelulares, similares a los formados tras tratar las raíces con BFA, aunque no eran compartimentos de BFA. De hecho, estas estructuras no podían ser teñidas con FM4-64 y eran insensibles a BFA. En la última parte de este trabajo se ha caracterizado el mutante PIN1:GFP-F165A. Estudios de inmunolocalización mostraron que PIN1:GFP-F165A no colocalizaba con marcadores del aparato de Golgi ni de compartimentos endosomales, pero sí con el marcador de ER BiP. In vivo, también se encontraron otros marcadores de ER en estas estructuras, como BiP, RFP-p245 o mCherry-HDEL, y experimentos utilizando FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) mostraron que estas estructuras eran las primeras en recuperar la fluorescencia, sugiriendo que éstas podían derivar del ER. Tras la inhibición de la síntesis proteica mediante el tratamiento con cicloheximida, las estructuras intracelulares que contenían PIN1:GFP-F165A desaparecieron de forma gradual, hasta que tras dos horas de tratamiento la proteína sólo estaba localizada en la membrana plasmática. Este efecto no estaba relacionado con la degradación de la proteína, sugiriendo que PIN1:GFP-F165A era capaz de alcanzar la membrana plasmática, aunque con una cinética más lenta. Diferentes ensayos de microscopía electrónica mostraron que PIN1:GFP-F165A se localiza en estructuras vesiculares rodeadas de varias capas de membrana (similares a las estructuras “onion-like” descritas anteriormente) y que se localizaban frecuentemente cerca de la membrana plasmática, posiblemente formadas como consecuencia de la acumulación de PIN1:GFP-F165A en las membranas del ER, lo que sería consistente con un defecto en la salida del retículo de este mutante. Para caracterizar la salida del ER de PIN1:GFP se realizaron experimentos de expresión transitoria en protoplastos de mesófilo de tabaco. La sobreexpresión de Hub1 (parte C-terminal de las cadenas pesadas de clatrina), que inhibe la formación de vesículas recubiertas de clatrina, causó una acumulación parcial de PIN1:GFP en estructuras intracelulares, similares a las observadas en las plantas PIN1:GFP-F165A, sin un efecto significativo en la localización de marcadores estándar de Golgi o compartimento prevacuolar (PVC). Por el contrario, la sobreexpresión de Sec12p, que inhibe la salida del ER dependiente de COPII, provocó la acumulación de marcadores de Golgi y PVC en el ER, mientras que no se observaron cambios significativos en la localización de PIN1:GFP. Estos datos sugieren que la clatrina podría estar involucrada en la salida de PIN1 desde el retículo endoplásmico.

Auxins are plant hormones involved in many physiological processes, such as cell growth and differentiation, fruit ripening, flowering or tropisms. Its transport through the plant is polar, playing an essential role in regulation of growth and development and contributing to the maintenance of global plant polarity. Polarity in auxin flux is due, at least in part, to the polar distribution of auxin efflux carriers of the PIN family, which depends on vesicle trafficking, particularly in a continuous cycling of PIN transporters between the plasma membrane and endosomal compartments. Specifically, PIN1 endocytosis has been shown to be clathrin-dependent and it is inhibited by auxin, whereas PIN1 recycling is GNOM-dependent and it is inhibited by brefeldin A (BFA). Nevertheless, sorting signals that allow the inclusion of PIN transporters in clathrin-coated vesicles for their intracellular traffic are still unknown. This work aims to investigate the molecular mechanisms that determine PIN1 polarity. In particular, it was intended to identify sorting signals in its cytosolic domain that determine its intracellular traffic and therefore its asymmetric distribution in plant cells. To this end, transgenic lines of Arabidopsis thaliana that express different mutant versions of PIN1:GFP in putative sorting signals, both in wild type (wt) and in pin1 background, were obtained. The phenotype recovery analysis suggests that residues F165, Y394 and Y480, present in the cytoplasmic loop of PIN1, may be important for PIN1 function. The subcellular localization and trafficking properties of PIN1:GFP mutant versions were analyzed. Two of these mutants, PIN1:GFP-F165A and PIN1:GFP-Y480A, showed differences in subcellular localization and also in traffic behaviour from PIN1:GFP, since they were mainly observed in big intracellular structures that could not be stained with FM4-64 and were BFA insensitive. Immunolocalization studies showed that PIN1:GFP-F165A neither localize to the Golgi apparatus nor to endosomal compartments, but colocalized with the endoplasmic reticulum (ER) marker BiP. In vivo, these structures were also found to contain ER markers, suggesting that they could be ER-derived structures. Immunogold labelling showed that PIN1:GFP-F165A localized to vesicular structures containing several layers of membranes, folded over each other (similar to previously described onion-like structures) and often localized close to the plasma membrane. Transient gene expression in tobacco mesophyll protoplasts was used to characterize ER export of PIN1:GFP. Overexpression of clathrin Hub1 (clathrin hub), which inhibits clathrin-coated vesicle formation, caused a partial accumulation of PIN1:GFP in intracellular structures, similar to those observed in PIN1:GFP-F165A plants, without a significant effect on the localization of a standard Golgi marker. In contrast, overexpression of Sec12p, that inhibits COPII-dependent ER export, caused the accumulation of Golgi or prevacuolar compartment (PVC) markers at the ER without any significant change in PIN1:GFP localization. These data suggest that clathrin may be involved in the ER export of PIN1.