Heterologous production and characterization of Lactococcus lactis prophage lysins LysP and LysT | Lactococcus lactis LysP ja LysT profaagilysiinien heterologinen tuotto ja karakterisointi

Faagilysiinit ovat lyyttisiä entsyymejä, jotka hydrolysoivat bakteerien soluseinän peptidoglykaania. Useimmilla faagilysiineillä on modulaarinen rakenne, jossa N-terminuksessa sijaitseva entsymaattisesti aktiivinen domeeni on liittynyt C-terminuksessa sijaitsevaan solun sidontaan erikoistuneeseen CBD-domeeniin. Villityypin Lactococcus lactis LAC460 kanta erittää kolmea profaagilysiiniä, LysL:ää, LysP:tä ja LysT:tä, joista LysL ja LysP käyttäytyvät kuten antimikrobiset yhdisteet, tappaen muita läheistä sukua olevia bakteereita. Näistä entsyymeistä vain LysL:n C-terminuksessa on osoitettu olevan solun sidontaan erikoistunut CBD-domeeni. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli karakterisoida LysP ja LysT entsyymejä tuottamalla niitä heterologisessa Lactococcus cremoris -kannassa, ja selvittää löytyykö niiden C-terminuksista CBD-domeenit. Työssä tutkittiin entsyymien antimikrobisia aktiivisuuksia indikaattorisoluja vastaan agarmaljoilla, solususpensioissa ja zymogrammigeelissä. Oletetut solun sidontaan erikoistuneet domeenit fuusioitiin vihreän fluoresoivan proteiinin (GFP) kanssa, jotta fuusioproteiinien sitoutumista indikaattorisoluun voitiin mitata fluoresenssilla. Työssä selvisi, että heterologisten tuottajaviljelmien supernatantit ja solulysaatit sisälsivät antimikrobisesti aktiivisia LysP ja LysT lysiinejä. Entsyymit osoittivat toimivansa itsenäisesti ilman muita faagiproteiineja, ja liikkuvansa epätyypillisen hitaasti zymogrammigeelissä. L. cremoris -kannassa tuotetut GFP-CBD fuusioproteiinit fluoresoivat vain heikosti, minkä seurauksena fuusioproteiinien sitoutumista indikaattorisoluihin ei pystytty osoittamaan. Näin ollen, LysP ja LysT lysiinien heterologinen ekspressio ja karakterisointi onnistuivat, mutta solun sidontaan erikoistuneiden domeenien olemassaolo jäi vielä selvitettäväksi.

Phage lysins are enzymes, which hydrolyze peptidoglycan on bacterial cell wall. Most phage lysins have a modular structure, where N-terminal enzymatically active domain is linked to a C-terminal cell binding domain (CBD). Wild-type Lactococcus lactis LAC460 secretes three prophage lysins, LysL, LysP, and LysT, of which LysL and LysP act as antimicrobial agents killing other closely related bacteria. Of these lysins, only LysL have been shown to contain a CBD in its C-terminus. The aim of this study was to characterize the LysP and LysT enzyme activities by producing them in a heterologous Lactococcus cremoris strain, and to investigate the existence of CBDs in their C-termini. Antimicrobial activities were studied against indicator cells on agar plates, in cell suspensions, and in zymographic gel. Putative CBDs were fused with green fluorescent protein (GFP) to measure fluorescence after binding the fusion proteins onto indicator cells. It was revealed that LysP and LysT antimicrobial activities were detected from heterologous producers’ cell-free supernatants and cell lysates. The lysins were shown to function independently without the need of other phage proteins, and their unusual slow migration in zymogram gel was confirmed. L. cremoris production of the GFP-CBD fusion proteins resulted in low fluorescence, which was insufficient for detecting the proteins’ binding onto indicator cells. In conclusion, heterologous expression and characterization of LysP and LysT were successful, while the existence of CBDs remained to be elucidated.