Regeneration and transformation of Eucalyptus grandis

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas

Eucalyptus grandis is the most widely used species in planted forests in tropical and subtropical areas. The traits of interest underlying Eucalyptus breeding programs concern productivity and wood quality for the pulp and paper industry, as well as biotic and abiotic stress tolerance. The development of an efficient transformation protocol is necessary to explore eucalypt resources through functional genomics and biotechnology. However, to achieve this goal, an efficient regeneration protocol is still needed. The main purpose of this work was to develop an efficient regenerationtransformation method for Eucalyptus grandis. To this end, we first concentrated our efforts on establishing an ideal micropropagation protocol to obtain good quality explants. Thirty in vitro culture conditions were tested, including different plant growth supplementations and media. The best result came from MS medium supplemented with 0.5 mg/l Zea and 0.2 mg/lNAA. The second step was to develop a reproducible regeneration system through organogenesis in E. grandis. To accomplish this goal, the following conditions were tested: a) different range of cytokinins (Zea, BAP, TDZ, Kin) and auxins (2,4D, NAA, IBA) in 50 different plant growth regulator combinations; b) different types of explants, obtained from micropropagated shoots (e.g. stem, leaf, or root segment) or derived from seedlings (e.g. hypocotyles with or without shoot apex, cotyledons, or roots); c) the effects of explant orientation; and d) different basal media (MS, WPM, ½ WPM). The highest rate of shoot regeneration (38%) occurred when using internode explants incubated on PIMMS followed by 2 mg/l BAP plus 1.0 mg/l NAA. After one month, stem explants were transferred to SIMMS with 4.0 mg/l BAP plus 0.2 mg/l NAA. Using leaf explants, a shoot regeneration rate of 20% was achieved when explants were cultured in 1.0 mg/l Zea plus 0.1 mg/l NAA in MS medium. All the regenerated shoots were rooted into MS medium (half strength) supplemented with 2 mg/l IBA. An important output of this study was the confirmation of the influence of seasons on the shoot regeneration ability of E. grandis. Finally, the transformation of E. grandis from clonal and seedling explants was done using the EHA105 Agrobacterium strain harboring the pMP2482 plasmid. This plasmid has a construct containing the coding sequences for the green fluorescent protein (GFP) and the -glucoronidase protein (GUS). The transformation frequency was 3.75% when root organogenesis was achieved. Transgenesis was verified by GFP visualization and histochemical detection of GUS activity. However, during the time course of this work, non transgenic shoots were recovered. In conclusion, the present study provides an efficient micropropagation and regeneration protocol designed to support the development of a reliable transformation method for E. grandis.

Eucalyptus grandis é a espécie mais utilizada em florestas cultivadas em áreas tropicais e subtropicais. Os caracteres de interesse que estão na base dos programas de melhoramento de Eucalyptus são a produtividade e a qualidade da madeira para a indústria da pasta de papel, assim como a tolerância a stress biótico e abiótico. Para a exploração dos recursos do eucalipto através da genómica funcional e da biotecnologia, é necessário o desenvolvimento de um protocolo de transformação eficiente. Contudo, para se atingir este objectivo, é ainda necessário um protocolo de regeneração eficiente. O principal objectivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método de regeneração-transformação eficiente para Eucalytus grandis. Com este fim, os nossos esforços concentraram-se no estabelecimento de um protocolo de micropropagação ideal para a obtenção de explantes de boa qualidade. Trinta condições de cultura in vitro foram testadas, incluindo diferentes suplementos e meios. O melhor resultado foi obtido com o meio MS suplementado com 0,5 mg/l de Zea e 0,2 mg/l de NAA. A segunda etapa foi o desenvolvimento de um sistema de regeneração reprodutível via organogénese em E. grandis. Para atingir este objectivo, as seguintes condições foram testadas: a) várias citoquininas (Zea, BAP, TDZ, Kin) e auxinas (2,4D, NAA, IBA) em 50 combinações de reguladores de crescimento diferentes; b) vários tipos de explantes, obtidos de rebentos micropropagados (e.g. segmentos de caule, folha, ou raíz) ou derivados de plântulas (e.g. hipocótilos com ou sem epicótilo e gema apical, cotilédones, ou raízes); c) a orientação do explante; e d) diferentes meios de cultura (MS, WPM, ½ WPM). A taxa de sucesso na regeneração de rebentos foi mais elevada (38%) quando foram usados como explantes entrenós cultivados em PIMMS, suplementado com 2 mg/l de BAP e 1,0 mg/l de NAA. Um mês mais tarde, os entrenós foram transferidos para SIMMS com 4,0 mg/l de BAP e 0,2 mg/l de NAA. Com explantes foliares, a taxa de regeneração de rebentos foi de 20% quando cultivados em meio MS com 1.0 mg/l de Zea e 0,1 mg/l de NAA. Todos os rebentos obtidos foram enraizados em meio MS/2 suplementado com 2 mg/l de IBA. Um resultado importante deste estudo foi a confirmação da influência da época do ano (estação) na capacidade de regeneração de rebentos em E. grandis. Por último, foi realizada a transformação de E. grandis a partir de explantes clonais e de plântulas usando a estirpe EHA105 de Agrobacterium transformada com o plasmídeo pMP2482. Este plasmídeo possui uma construção contendo as sequências codificantes da proteína verde fluorescente (GFP) e da -glucoronidase (GUS). A frequência de transformação foi de 3,75% quando foi obtida organogénese de raízes. A transgénese foi verificada através de visualização da GFP e detecção histoquímica da actividade da GUS. No entanto, durante o tempo destinado a este trabalho, não foram obtidos rebentos trangénicos. Em conclusão, este estudo propõe um protocolo de micropropagação e regeneração eficiente concebido para apoiar o desenvolvimento de um método fiável de transformação em E. grandis.

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Projects" P-KBBE/AGR-GPL/0001/2010 - TREEFORJOULES - Improving eucalypt and poplar wood properties for bioenergy" and "PTDC/AGRGPL/ 098179/2008 - Did you ask for something small? The microRNAs power in a Eucalyptus tension world!".