Loss of proteostasis in cancer and its relation with acquired resistance to endocrine therapy | Perda de proteostase no cancro e a sua relação com a resistência adquirida à terapia endócrina

Cancer has enormous costs for society with breast and prostate cancers accounting for the first and fifth cause of death among cancer patients. About 50% of the initially responsive breast cancers and almost all prostate cancers develop resistance to endocrine therapy, progressing towards a more aggressive, metastatic, and incurable disease. Thus, discovery of novel biomarkers to monitor patients’ response as well as new drug targets to surpass resistance are urgently needed. Cancer cells thrive under physiologic conditions that induce oxidative and proteotoxic stress, leading to protein misfolding and aggregation, which results in loss of proteostasis. To resolve proteotoxic stress, cells activate protein quality control mechanisms, being the Unfolded Protein Response (UPR) one of them. While it has been shown that specific UPR branches are activated in endocrine resistant breast and prostate cancer cells, there is nearly no knowledge about the specific proteins that aggregate, the biological processes they regulate, how protein aggregates affect cell survival and how this influences the acquisition of a resistant phenotype. Therefore, we proposed to identify and characterize the changes in signalling pathways regulating the proteostasis network leading to protein aggregation in endocrine-responsive vs resistant breast and prostate cancer cells. We characterized the aggregated proteome of breast cancer cell lines and identified a novel protein involved in acquired antiestrogen resistance – RNA-Splicing Ligase RtcB homolog (RTCB). We also explored the predictive value of RTCB and the endoplasmic reticulum chaperone BiP (BiP) in luminal breast cancer and evaluated the effect of antiestrogen therapy and metastasis on RTCB aggregation, aggresome formation and BiP expression. Our results show that RTCB aggregation status could be used as a potential predictive tool to evaluate the response of breast cancer patients to antiestrogen therapy. In addition, by combining three different strategies (analysis of publicly available datasets; systematic review and meta-analysis of immunohistochemistry (IHC) detection of BiP in human breast cancers; and IHC detection of BiP in our own cohorts) we confirmed the potential of BiP as an indicator of poor prognosis for breast cancer patients. We showed that castration resistant prostate cancer (CRPC) cells protect their proteome from flutamide-induced toxic aggresome accumulation through the activation of two distinct stress responses that work in concert. The antioxidative stress response is firstly activated to cope with reactive oxygen species (ROS) production. Secondly, UPR activation results in a transient inhibition of protein translation to avoid protein aggregation/ aggresome formation. We also identified Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3 (PERK) as a novel protein involved in acquired antiandrogen resistance in CRPC cells. Thus, with this work, we propose for the first time, that protein aggregation patterns could be indicative of the capacity of cells to maintain a healthy proteome in response to treatment, which provides a new perspective of proteostasis, where protein aggregation can be used to identify novel biomarkers and drug targets and should be considered as a novel approach to understand mechanisms of disease.

As doenças oncológicas representam um enorme custo para a sociedade, sendo os cancros da mama e da próstata a primeira e a quinta causa de morte por cancro. Aproximadamente 50% dos cancros da mama e quase todos os cancros da próstata que inicialmente respondem à terapia endócrina desenvolvem resistência, progredindo para uma forma da doença que é mais agressiva, metastática e incurável. A descoberta de novos biomarcadores para monitorizar a resposta dos pacientes à terapia endócrina, bem como a descoberta de novos alvos terapêuticos que permitam ultrapassar o problema da resistência, são, portanto, uma necessidade urgente. As células cancerígenas proliferam sob condições fisiológicas que induzem stress oxidativo e proteotóxico. Estas condições levam à má formação de proteínas e à sua agregação, o que, consequentemente, pode resultar na perda de proteostase. De modo a resolverem o stress proteotóxico, as células ativam mecanismos de controlo de qualidade das proteínas, sendo um deles a Resposta a Proteínas Malformadas (UPR). Nos últimos anos tem sido demonstrado que ramos específicos da UPR são ativados nas células de cancro da mama e da próstata resistentes à terapia endócrina. No entanto, pouco se sabe acerca das proteínas que agregam, os processos biológicos que estas proteínas regulam, como é que os agregados de proteínas afetam a sobrevivência das células ou como é que este processo influencia a aquisição de um fenótipo de resistência. Assim sendo, o objetivo desta tese foi identificar e caracterizar as alterações nas vias de sinalização que regulam a rede de proteostase e que levam à agregação de proteínas em células de cancro da mama e da próstata resistentes vs sensíveis à terapia endócrina. Neste trabalho caracterizámos o proteoma agregado de linhas celulares de cancro da mama e identificámos uma nova proteína envolvida na aquisição da resistência a antiestrogénios – a Ligase de splicing de RNA homóloga de RtcB (RTCB). O valor preditivo da RTCB e da chaperona do reticulo endoplasmático BiP (BiP) foi também explorado em tumoures da mama com diferenciação luminal. Avaliou-se ainda o efeito da terapia com antiestrogénios e da metastização na agregação da RTCB, na formação de agressomas e na expressão de BiP nestes tumoures. Os nossos resultados mostram que o estado de agregação da RTCB poderá ser utilizado como uma potencial ferramenta preditiva para avaliar a resposta à terapia com antiestrogénios em pacientes com cancro da mama. Adicionalmente, ao combinar a utilização de três estratégias complementares (análise de bases de dados públicas; revisão sistemática e meta-análise da deteção imunohistoquímica (IHC) de BiP em casos de cancro da mama; e a deteção por IHC de BiP nas nossas próprias coortes) conseguimos confirmar que a deteção da expressão de BiP em pacientes com cancro da mama tem o potencial para ser utilizada como um indicador de mau prognóstico. Nesta tese demonstramos ainda que as células de cancro da próstata resistentes à castração (CRPC) protegem o seu proteoma da acumulação tóxica de agressomas induzida pela flutamida através da ativação de duas respostas de stress distintas. Primeiro, a resposta ao stress oxidativo é ativada de modo a eliminar as espécies reativas de oxigénio (ROS) produzidas pela terapia. Em seguida, a ativação da UPR resulta numa inibição temporária da tradução de modo a evitar a agregação de proteínas/ formação de agressomas. O factor 2-alfa cinase 3 de iniciação de tradução eucariótica (PERK) foi também identificado como uma nova proteína envolvida na aquisição da resistência ao antiandrogénio flutamida nas células CRPC. Assim sendo, nesta tese, propomos pela primeira vez, que os diferentes padrões de agregação de proteínas poderão ser indicativos da capacidade que as células têm para manter o seu proteoma saudável em resposta ao tratamento. A proteostase é analisada de uma nova perspetiva, onde se demonstra que os agregados de proteínas podem ser utilizados para identificar novos biomarcadores e novos alvos terapêuticos e deverão ser considerados como uma nova abordagem para compreender os mecanismos de diversas doenças.

Programa Doutoral em Biomedicina