The role of insulin signalling in Alzheimer’s disease | A importância da sinalização da insulina na doença de Alzheimer

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder. The number of people with dementia is projected to increase from 57 million in 2019 to around 152 million by 2050, posing a significant public health challenge. AD can be familial, or sporadic. Molecularly, it involves Aβ peptide production, tau protein changes, synaptic loss, and inflammatory processes. Various AD risk factors have been described, and some were here confirmed by the characterization of a primary care-based cohort (pcb-Cohort) comprising around 600 individuals 60 years old or more. Strikingly in this study we reported for the first time a correlation between cognitive deficits and gastrointestinal disorders and confirmed a previous observation whereby Diabetes Mellitus (DM) was a comorbidity associated with deficits in cognition. Unexpectedly APOEε2 allele carriers showed relative protection against both conditions. Emerging evidence associates impaired brain insulin signalling and insulin resistance to AD. Armed with the cohort study, we investigated how the two pathologies might be associated at a molecular level, using an ‘in silico’ approach. Bioinformatics analysis identified 32 key synaptic proteins shared between AD and insulin signalling pathways. MAPK signalling emerged as a central hub, highlighting its significance in this molecular link between AD and insulin resistance. Other key hubs included protein phosphatases and protein kinases, in particular GSK3β and Fyn. Increased GSK3β and Fyn activities have been linked to AD onset, with both kinases phosphorylating critical proteins involved in AD pathology. The first part of this work, described in Chapter II, provided the basis to strengthen the hypothesis that dysregulated insulin signalling impacted several important neuronal processes, contributing to AD pathogenesis. Thus, the subsequent chapters assessed the impact of insulin signalling and insulin resistance (IR) in several key AD pathways, with the aim of identifying and describing a clear overlap between Type 2 Diabetes (T2D) and AD. In the early 21st century, discoveries of insulin receptors in the brain, insulin mRNA, and an insulin transporter at the blood-brain barrier changed our understanding of the brain's sensitivity to insulin. Neurons don't need insulin for glucose uptake but require it for memory and synaptic plasticity. GSK3β and Fyn, key kinases for AD and T2D, were studied under two pathological pressures; IR relevant for T2D and Aβ exposure which mimics AD. The results are presented in Chapter III and confirmed that IR promotes non-amyloidogenic APP processing, possibly due to increased Fyn levels. Significantly we showed that Fyn favours non-amyloidogenic APP processing, as lower Fyn levels led to increased Aβ levels. This is the first report demonstrating Fyn as having a role in non-amyloidogenic APP processing. Reducing Fyn levels also decreased GSK3β phosphorylation. Moreover, GSK3β downregulation increased APP phosphorylation and decreased APP processing. Another important conclusion reached by this work is that IR alone is unlikely to initiate amyloidogenic APP processing, but it can create conditions that contribute to molecular and cellular anomalies that will promote and amplify AD associated anomalies.Collectively, the results obtained suggest common molecular and cellular dysregulation for T2D and AD, potentially affecting the same signalling pathways. For signal transduction response protein:protein complexes are central to signal transduction. Thus, in Chapter IV the interactomes for GSK3β and Fyn where developed, using data available in public repositories but also experimental outputs using immunoprecipitation and mass spectrometry. Several shared proteins associated with both pathologies, including PPP2R1A, HSPA5, HSPA8, HMGA1, SBSN, VIM, and DDX5 were identified. All these proteins, except PPP2R1A, interacted with both Fyn and GSK3β. Some interactors responded to IR, while others reacted to Aβ exposure. These findings have implications for potential diagnostic and therapeutic strategies. Notably, the interaction between PPP2R1A and Fyn, reported here for the first time, is significant as PPP2R1A binds to protein phosphatase 2A (PP2A), a crucial player in tau dephosphorylation. Naturally this study focused on how mitochondria, essential organelles for maintaining healthy cells and metabolic balance, respond to insulin resistance IR and Aβ exposure in the context of insulin stimulation. Live confocal imaging and automatized image analysis were used to monitor various mitochondrial parameters like mean intensity, size, speed, velocity, fission, and fusion, results are presented in Chapter V. Under all conditions (IR, insulin, and Aβ exposure), the mitochondrial network reorganized, leading to decreased mitochondrial surface area and volume. In IR cells, the minor axis length reduced, resulting in more elongated mitochondria. When comparing perinuclear and telenuclear mitochondria, several parameters decreased, with smaller mitochondria, while the mean TMRM intensity remained constant. Notably, in cells treated with insulin, the mitochondrial network extended more into neuronal cellular processes. These findings shed light on the mitochondrial dysregulation often associated with T2D and AD, contributing to our understanding of these conditions. The work from this thesis contributed to understanding how T2D and AD overlap at a molecular level and several findings were here reported for the first time. Furthermore, several signalling pathways and binding proteins were forthcoming and may represent attractive targets for future diagnostic and therapeutic strategies.

A doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum. O número de pessoas com demência está projetado para aumentar de 57 milhões em 2019 para cerca de 152 milhões de pessoas em 2050, constituindo um problema de saúde público. A DA pode ser de origem familial ou esporádica. Molecularmente, envolve a produção do péptido Aβ, alterações na proteína tau, perdas sinápticas e processos inflamatórios. Vários fatores de risco já foram descritos, e alguns foram confirmados pela caracterização de um cohort de cuidados básicos (pcb-cohort) com cerca de 600 indivíduos com 60 anos ou mais. Surpreendentemente neste estudo, reportámos pela primeira vez a correlação entre défices cognitivos e doenças gastrointestinais e confirmámos a correlação entre a diabetes mellitus e o desenvolvimento de problemas cognitivos. Inesperadamente, os pacientes com alelos APOEε2 mostraram um fenótipo de proteção contra o desenvolvimento de DM. Evidências recentes associam a desregulação da sinalização de insulina e a resistência à insulina neuronal ao desenvolvimento da DA. Tendo em conta a associação prévia da DM à DA no nosso cohort, fomos explorar como as duas patologias poderiam estar associadas a um nível molecular, usando uma abordagem “in silico”. A análise bioinformática identificou 32 proteínas chave entre a DA e a sinalização de insulina, na sinapse. A sinalização MAPK emergiu como eixo central. Outras pontos centrais foram identificados, incluindo proteínas fosfatases e proteínas cinases, em particular a GSK3β e a Fyn. O aumento de atividade da GSK3β e da Fyn já foram associados com o início do desenvolvimento da DA, com estas cinases envolvidas na fosforilação de proteínas envolvidas na patogénese da DA. A primeira parte deste trabalho, descrito no capítulo II, ofereceu a base para reforçar a hipótese que a desregulação da sinalização da insulina impacta vários importantes processos neuronais, contribuindo para a DA. Por isso, os capítulos subsequentes avaliaram o impacto da sinalização da insulina e da resistência à insulina (RI) em vários processos chaves da DA, com o objetivo de identificar e descrever uma sobreposição entre a tipo 2 diabetes (T2D) e a DA. No início do século 21, as descobertas de recetores de insulina no cérebro, mRNAs da insulina e transportadores de insulina na barreira hematoencefálica mudaram o nosso conhecimento acerca da sensitividade do cérebro à insulina. Neurónios não necessitam de insulina para a absorção de glucose, mas necessitam para a formação de memórias e plasticidade sináptica. A GSK3β e a Fyn, cinases chaves na DA e T2D, foram estudadas sob duas pressões patológicas; RI relevante para a T2D e exposição ao Aβ para mimetizar a DA. Os resultados são apresentados no capítulo III e confirmaram que a RI promove a clivagem da APP pela via não-amiloidogénica, possivelmente devido a um aumento dos níveis de Fyn. Significativamente, mostrámos que a Fyn favorece a via não-amiloidogénica de clivagem da APP, visto que uma diminuição nos níveis de Fyn resultou num aumento de produção de Aβ. Este é o primeiro estudo que demonstra que a Fyn tem um papel na clivagem não-amiloidogénica da APP.A redução dos níveis de Fyn também reduziu os níveis de fosforilação da GSK3β. Além disso, diminuição dos níveis de GSK3β aumentou a fosforilação da APP e diminuiu o seu processamento. Outra conclusão importante alcançada com este trabalho foi que a RI sozinha é improvável de iniciar o processamento amiloidogénico da APP, mas pode criar as condições para contribuir para outras anomalias celulares e moleculares, promovendo e amplificando outros processos associados à DA. Coletivamente, os resultados obtidos sugerem desregulação molecular e celular comum para T2D e DA, afetando potencialmente as mesmas vias de sinalização. Para a resposta de transdução de sinal, os complexos proteína:proteína são centrais para a transdução de sinal. Assim, no Capítulo IV foram desenvolvidos os interactomas para GSK3β e Fyn, utilizando dados disponíveis em repositórios públicos, mas também resultados experimentais utilizando imunoprecipitação e espectrometria de massa. Várias proteínas compartilhadas associadas a ambas as patologias, incluindo PPP2R1A, HSPA5, HSPA8, HMGA1, SBSN, VIM e DDX5 foram identificadas. Todas estas proteínas, exceto PPP2R1A, interagiram tanto com Fyn quanto com GSK3β. Alguns interatores responderam à RI, enquanto outros reagiram à exposição ao Aβ. Estes resultados têm implicações para possíveis estratégias diagnósticas e terapêuticas. Notavelmente, a interação entre PPP2R1A e Fyn, relatada aqui pela primeira vez, é significativa, pois o PPP2R1A liga-se à proteína fosfatase 2A (PP2A), um participante crucial na desfosforilação da tau. Naturalmente, este estudo focou-se em como as mitocôndrias, organelos essenciais para o bom funcionamento celular e metabólico, responde à RI e à exposição ao Aβ. Microscopia confocal ao vivo e análise automatizada de imagens foram usados para monitorizar vários parâmetros mitocondriais, como a intensidade média, tamanho, velocidade, fissão e fusão, e estes resultados são apresentados no capítulo V. Em todas as condições (RI, tratamento com insulina e com Aβ), existiu uma reorganização mitocondrial, levando a uma diminuição da área superficial e volume das mitocôndrias. Em células RI, o tamanho do eixo menor diminuiu, resultando em mitocôndrias mais alongadas. Quando comparámos mitocôndrias perinucleares e telenucleares, vários parâmetros diminuíram, apontando para mitocôndrias telenucleares mais pequenas, sem afetar a sua intensidade média. Estes resultados ajudaram na compreensão das disfunções mitocondriais observadas em pacientes com T2D ou DA. O trabalho desta tese contribuiu para a compreensão de como o T2D e a DA se sobrepõem a nível molecular e vários resultados foram aqui relatados pela primeira vez. Além disso, várias vias de sinalização e proteínas de ligação foram encontradas e podem representar alvos atraentes para futuras estratégias diagnósticas e terapêuticas.

Programa Doutoral em Biomedicina