Functional characterization of unassigned african swine fever virus proteins putatively involved in transcription and replication towards an efficient vaccine design

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas

African swine fever (ASF) is an infectious disease of domestic pigs and wild boars with mortality rates reaching up to 100% and is endemic in most of the Sub-Saharan countries. In 2007 it was introduced in Georgia and spread to neighbouring countries, reaching the Russian Federation, several European countries and, more recently, China and Vietnam (February 2019). Currently, there is neither a vaccine nor a treatment against ASF and the control of the disease depends strictly on sanitary measures, including stamping out and trade bans of animals and pork products leading to devastating socio-economic losses to affected countries. The etiologic agent of the disease is African swine fever virus (ASFV), a large (approx. 190 nm) double-stranded DNA (170 to 193 kbp) enveloped virus. ASFV genome encloses more than 150 open reading frames (ORFs) and to this date most of them lack any known or predictable function. ASFV is quite independent from cellular machinery encoding enzymes required for replication, transcription and virion assembly, including the putative I215L E2 Ubiquitin-conjugating enzyme, QP509L, Q706L RNA Helicases and the P1192R type II topoisomerase. The E2 ubiquitin-conjugating enzymes are part of the essential cellular post-transcriptional regulation ubiquitin-proteasome pathway. In this study, the pI215L binding activity was characterized as being mono and poly-ubiquitinated in the Cys85 at different temperatures and pH values. Moreover, I215L gene is transcribed from 2 hours post infection (hpi), and immunoblot analysis confirmed that pI215L is expressed from 4 hpi being detected all over the cell specially in the viral factories from 8 hpi. Downregulation assays by siRNA suggested that pI215L plays a critical role in the transcription of late viral genes and in viral DNA replication. RNA helicases are described as essential for infections, modulating RNA-RNA and RNA-protein interactions, gene expression, viral egress and host antiviral responses. In the present work, we found that QP509L, Q706L are conserved between ASFV virulent and non-virulent isolates. Furthermore, ASFV-QP509L and Q706L are actively transcribed from 2 hours post infection, and both proteins are localized in the viral factories at 12 hours post infection. However, QP509L was also detected in the cell nucleus. Transcript downregulation uncovered the essential role of these proteins during viral cycle progression, in particular for the late transcription. Type II topoisomerases are involved in resolving DNA tangles and supercoils by cutting the duplex and allowing the DNA replication to proceed. In this study, we report that P1192R is actively transcribed throughout infection, being detected from 2 hpi and reaching a maximum concentration around 16 hpi. P1192R knockdown experiments revealed its critical role for viral infection, given by a reduction in viral transcripts, cytopathic effect, the number of viral factories per cell, and virus yields. We also demonstrated that enrofloxacin exposure during the late phase of infection induces viral genomes fragmentation, whereas, when added at early phase of infection completely abolishes replication. The data obtained from I215L, QP509L. Q706L and P1192R characterization studies opens new venues to the rational design of a mutant virus lacking these genes, and also points new pathways to be targeted by antiviral drugs.

RESUMO - Caracterização funcional de proteínas do vírus da peste suína Africana putativamente envolvidas na transcrição e replicação com o intuito de desenvolvimento de uma vacina. - A peste suína africana é uma doença viral infeciosa que afeta os suínos domésticos e os selvagens, com taxas de mortalidade perto dos 100%, originando perdas económicas elevadas nos países afetados. A doença é endémica na maioria dos países subsaarianos, e desde 2007, assistiu-se uma expansão nos países Europeus, incluindo membros da União Europeia, e mais recentemente, na China e Vietname. Atualmente não existe vacina ou tratamento para esta infeção e o controlo da doença baseia-se no diagnóstico rápido, na eliminação compulsiva dos suínos e no bloqueio ao comércio de suínos e produtos derivados. O agente etiológico é o vírus da peste suína africana (VPSA), um vírus composto por uma molécula de ADN de cadeia dupla (170 to 193 kbp) contendo mais de 150 grelhas de leitura. Algumas destas estão devidamente caracterizadas codificando para proteínas estruturais ou regulatórias, contudo, a grande maioria foi identificada por homologia de sequência com outros vírus não se conhecendo, até à data, qual a sua função durante a infeção. Apesar dos inúmeros esforços ao longo dos anos, a complexidade viral, a falta de conhecimento sobre muitos dos aspetos da biologia do vírus e das suas interações com o hospedeiro invalidaram a obtenção de uma vacina segura e eficaz. Por um lado, as abordagens clássicas embora promissoras não garantem proteção contra estirpes heterólogas, enquanto a produção de vacinas de ADN ou proteína, mesmo com adjuvantes, não induzem imunidade contra uma segunda infeção. No entanto, a identificação de suínos previamente infetados e que resistem a novas infeções reforça a ideia da possibilidade de se obter uma imunidade protetora. Dadas as circunstâncias atuais de expansão da doença, estudos recentes apontam a necessidade de se aprofundar o conhecimento sobre os aspetos da biologia do VPSA com vista a identificação de novas estratégias para o desenvolvimento racional de vacinas ou de identificação de novos alvos para o uso de fármacos com vista a controlar a infeção. Neste contexto, os estudos apresentados neste trabalho caracterizam a I215L, QP509L, Q706L e P1192R, identificadas inicialmente, por homologia de sequência com outras proteínas tipicamente envolvidas na replicação e transcrição de outros vírus. A I215L foi identificada por partilhar identidade com as enzimas E2 de conjugação da ubiquitina. Estas enzimas pertencem a uma cadeia de sinalização do sistema de regulação pós-transcricional ubiquitina-proteossoma. Os estudos realizados revelaram que a pI215L tem a capacidade de receber uma ou duas ubiquitinas (mono e di-ubiquitinada) no resíduo Cisteína-85, a diferentes temperaturas e valores de pH, evidenciando a sua plasticidade em participar em diferentes fases da infeção quer no hospedeiro quer no vetor. Além disto, o gene é transcrito precocemente (2 horas após infecção, hpi) e a proteína expressa desde as 4h, sugerindo que esta deverá ser necessária desde o início da infecção. Paralelamente, os nossos estudos por imunofluorescência revelaram uma distribuição da pI215L por toda a célula, e em especial, nas fábricas virais, sugerindo um papel ativo na regulação de vários processos, incluindo replicação de ADN e da transcrição. Os ensaios de ARN de interferência (siRNA) contra o I215L demonstraram um papel essencial desta proteína durante a infeção, originando uma redução dos transcritos tardios, do número de genomas (-63 a -68%) e na libertação de partículas infeciosas (até -94%). [...]

N/A