The potential of ABT-263 as a therapeutic agent in spinal cord injury-induced peripheral pathology

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, área científica de Morfologia e Função,

Spinal cord injury (SCI) is a serious neurological condition characterized by motor and sensory impairments, often associated with the induction of peripheral secondary conditions. There are two main causes identified for this peripheral pathology: the severance of the sympathetic nervous system and its supraspinal control; and a systemic and chronic inflammatory response. The elimination of SCI-induced senescent cells using the senolytic ABT-263 is responsible for significant motor, sensory and bladder improvements. These are also correlated with the reduction of detrimental cytokines, chemokines and senescent-associated secretory phenotype (SASP) factors. In our study, we hypothesized that the accumulation of SASP factors in the injured spinal cord could be responsible for its systemic spread and induction of senescence, SASP and, consequently, pathology in peripheral organs. As ABT-263 is beneficial for spinal cord repair outcome, we wanted to address if its effect was sustained in the periphery, and, therefore, attenuate secondary conditions. We evaluated the cytokine profile of the spinal cord, liver and bladder from T9 SCI mice taken from vehicle- and ABT-263-treated animals at different days post-injury (dpi). In addition to this, the histopathology and senescence profile were evaluated using H&E, and other special stainings, including SA-b-gal, respectively, as well as immunohistochemistry to assess inflammation. Image analysis and quantifications were done using QuPath. Our results showed a chronic induction of pro-inflammatory factors in the spinal cord at 30 dpi and a loss of effectiveness of ABT-263 compared with the 15 dpi. In the liver at 15 dpi, inflammatory cytokines and pro-fibrotic factors were upregulated with SCI, however, ABT-263 was not successful in decreasing their expression. At the same time, an increase in the number of senescent cells was observed in the animals treated with ABT-263 suggesting some degree of hepatotoxicity. This was onfirmed by an upregulation of pro-fibrotic and proinflammatory factors in the liver of ABT-263-treated animals at 30 dpi. Notwithstanding, at 15 dpi histopathology did not yet show significant pathological alterations. The spleen appeared to not be affected at this injury level. The bladder also revealed a chronic inflammatory and pro-fibrotic microenvironment and phenotype. However, the beneficial effects of ABT-263 were only observed at 30 dpi, suggesting an intermediate modulation by ABT-263 between 15 and 30 dpi. In conclusion, there is no irrefutable evidence that SASP becomes systemic and is responsible for the induction of senescence and pathology in other organs after SCI, at least at 15 dpi. Further studies are warranted

RESUMO - O potencial do ABT-263 como agente terapêutico na patologia periférica associada a lesões da medula espinhal - Lesões na medula espinhal (LME) são alterações neurológicas severas, caracterizadas por défices motores e sensitivos, que estão frequentemente associados à indução de alterações periféricas secundárias. Duas principais causas responsáveis por esta patologia periférica são: a interrupção mecânica da inervação do Sistema Nervoso Simpático e o seu controlo supra-espinhal; e a resposta inflamatória sistémica associada. A eliminação de células senescentes induzidas por LME, através do uso do senolítico ABT-263, é responsável por uma melhoria significativa da função motora, sensitiva e da bexiga. Estas estão também associadas à redução de citoquinas, quimiocinas e de fatores do fenótipo secretor associado à senescência (SASP). No nosso estudo, colocámos a hipótese de que a acumulação dos fatores SASP na medula espinhal poderia ser responsável pela sua difusão sistémica e, desta forma, a indução de senescência, SASP, e consequentemente patologia nos órgãos periféricos. Como o ABT-263 foi benéfico na medula espinhal, quisemos avaliar se o seu efeito se mantinha na periferia, atenuando as condições secundárias. Avaliámos o perfil de citoquinas da medula espinhal, fígado e bexiga de murganhos com LME ao nível da T9, tratados com veículo ou ABT-263 em diferentes dias pós-lesão (dpl). Para além disto, a histopatologia e o perfil de senescência foram avaliados usando H&E, e outras colorações, incluindo o SA-b-gal, respetivamente, bem como imunohistoquímica. A análise de imagem e respetivas quantificações foram realizadas usando o QuPath. Os nossos resultados demonstraram a indução crónica aos 30 dpl na medula espinhal de fatores pro-inflamatórios e uma perda de eficácia do ABT-263 comparado com os 15 dpl. No fígado, aos 15 dpl observou-se a indução de citoquinas inflamatórias e fatores pró fibróticos. No entanto, o ABT-263 não conseguiu diminuir a expressão destes fatores. Ao mesmo tempo, houve um aumento do número de células senescentes no grupo tratado com ABT-263, sugerindo hepatoxicidade. Isto foi confirmado pela indução de fatores pro-fibróticos e pro-inflamatórios no fígado dos animais tratados com ABT-263 aos 30dpl. Não obstante, aos 15 dpl não havia alterações histopatológicas significativas. O baço não parece ser afetado por lesão a este nível. A bexiga também revelou um microambiente e fenótipo inflamatório e pro-fibrótico. Todavia, os efeitos benéficos do ABT-263 apenas foram observados aos 30 dpl, sugerindo uma possível modulação intermédia entre os 15 e os 30 dpl. Concluindo, neste momento ainda não foi possível de forma irrefutável demonstrar a existência de um SASP sistémico, responsável pela indução de senescência e pela patologia periférica já descrita. Mais estudos são necessários

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