Desenvolvimento e validação de um método de deteção de DNA animal em produtos alimentares vegetarianos por PCR em tempo real

Mestrado em Engenharia Alimentar. Universidade de Lisboa, Instituto Superior de Agronomia

A descrição fraudulenta e imprecisa do conteúdo dos produtos alimentares tem um efeito negativo na confiança dos consumidores, e, deste modo, na ação da compra de um determinado produto. Assim, é necessário transmitir confiança aos consumidores, através da realização de testes, de forma a garantir que um determinado produto não foi adulterado. O número de vegetarianos tem vindo a aumentar ao longo dos anos, tendo as empresas do setor alimentar vindo a procurar desenvolver técnicas que permitam garantir a veracidade dos rótulos, utilizando testes que comprovem que um produto é 100% vegetariano e que não tem qualquer tipo de contaminação animal. Atualmente existem técnicas que permitem identificar, por meio de análises de DNA, os ingredientes presentes num produto, de modo a garantir a sua autenticidade. Os métodos mais comuns são a Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a Cromatografia gasosa, e a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Neste projeto foi desenvolvido um método de deteção de DNA animal em produtos vegetarianos utilizando a técnica de real time PCR. Foram selecionados um conjunto de primers e sonda para a deteção de DNA de vertebrados (VT) e um conjunto de primers e sonda para a deteção de DNA vegetal (PL). Este segundo par de primers como controlo interno permitindo confirmar a presença de DNA na amostra em caso de resultado negativo para a presença de DNA de vertebrados. O primeiro passo para a validação do método foi a realização da otimização do mesmo para aferir as melhores condições de reação de PCR para cada par de primers. De seguida procedeu-se à validação do método, testando a sua especificidade (inclusividades e exclusividades), limites de deteção absolutos, limites de deteção relativos e robustez. Por último e de forma a comprovar que o método tem um bom desempenho em condições reais foram testados produtos alimentares, contendo produtos à base vegetal e produtos de origem animal. Foram obtidos bons resultados durante a otimização e validação do método permitindo obter um método 100% específico, robusto e com bons limites de deteção. Os resultados obtidos ao testar produtos alimentares também mostraram que o método funciona em condições reais e foi possível obter resultados válidos.

The fraudulent and inaccurate description of the content of food products harms consumer confidence, and consequently the act of purchasing a particular product. Thus, it is necessary to convey confidence to consumers, by carrying out tests to guarantee that a given product has not been adulterated. The number of vegetarians has been increasing over the years, with companies in the food industry seeking to develop techniques to guarantee the veracity of their labels, proving that a product is 100% vegetarian and does not have any contamination of animal DNA. Currently, some techniques make it possible to identify, through DNA analysis, the ingredients and composition of each product, to guarantee its authenticity. The methods most commonly used are High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), Gas Chromatography and Polymerase Chain Reaction (PCR). In this project, a method for detecting animal DNA in vegetarian products was developed using the real-time PCR technique. A set of primers and probes for detecting vertebrate DNA (VT) and plant DNA (PL) were selected. The latter served as an internal control to confirm the presence of DNA in the sample in case of a negative result for the presence of vertebrate DNA. The first step in validating the method was to perform its optimization to assess the best PCR conditions for each pair of primers. Then, the method was validated by testing its specificity (inclusiveness and exclusivity), absolute detection limits, relative detection limits, and reliability. Finally, to prove the method performed well under real conditions, food products containing plant-based products and animal-based products were tested. Satisfactory outcomes were obtained during the optimization and validation of the method, thus obtaining a 100% specific, robust method with adequate detection limits. The results obtained when testing food products also revealed the method works in real conditions and it was possible to obtain valid results.

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