Estilbenos como una alternativa sostenible al anhídrido sulfuroso en vinos. Evaluación de la toxicidad del extracto de estilbeno

La demanda de los consumidores por alimentos cada vez más naturales está creando una tendencia creciente en la industria alimentaria hacia el empleo de ingredientes y aditivos naturales como alternativa a los conservantes químicos. En este sentido, la búsqueda de alternativas al uso del dióxido de azufre (SO2) en la industria del vino es un campo en auge. Una de las estrategias que se ha encontrado para cubrir esta necesidad ha sido el uso de estilbenos debido a sus interesantes propiedades antimicrobianas y antioxidantes. Además, estos compuestos se encuentran de forma natural en los sarmientos de la vid, subproductos de la industria vitinícola con valor añadido nulo actualmente. La posibilidad de incrementar el valor añadido de los subproductos que se producen en las bodegas es de gran interés, ya que se estima que se generan entre 2 y 4 toneladas por hectárea de viñedo y año, según datos recientes de la Organización Mundial de la Viña y el Vino (OIV). El empleo de estas sustancias en la industria alimentaria debe ser seguro para los consumidores. En este sentido, hemos revisado la bibliografía existente relacionada con estudios de toxicidad in vitro e in vivo de tres estilbenos: piceatanol, pterostilbeno y ε-viniferina. Estos compuestos fueron escogidos debido a que se encuentran de manera abundante en la naturaleza y poseen propiedades biológicas interesantes para su uso en alimentos. Sin embargo, hasta el momento, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) no ha publicado ninguna evaluación de estos compuestos para garantizar su seguridad como aditivos. En esta revisión, se puso de manifiesto que estos estilbenos presentan una importante citotoxicidad en líneas celulares cancerígenas y no cancerígenas. Además, el daño en el ADN inducido por estos compuestos se ha demostrado por varios métodos como un posible mecanismo de citotoxicidad. Sin embargo, el potencial genotóxico in vitro del piceatanol, pterostilbeno y la -viniferina se ha estudiado poco y no se han realizado estudios siguiendo las directrices de la EFSA. En cuanto a los efectos in vivo, no existen estudios que valoren el potencial genotóxico en modelos in vivo ya que la mayoría de los autores se han centrado en sus propiedades beneficiosas. Por lo tanto, para garantizar la seguridad del uso de piceatannol, pterostilbeno y ε-viniferina, se necesitan más estudios de acuerdo con las recomendaciones de la EFSA que evalúen los efectos genotoxicos in vitro e in vivo. Esta revisión ha dado lugar a la siguiente publicación: • TOXICOLOGICAL EVALUATION OF PICEATANNOL, PTEROSTILBENE AND ε-VINIFERIN FOR THEIR POTENTIAL USE IN THE FOOD INDUSTRY: A REVIEW (Medrano-Padial et al., 2021. Food Control (en revision). La presente tesis doctoral se engloba dentro de un proyecto coordinado con el grupo del Instituto de Formación e Investigación Agraria y Pesquera (IFAPA) de la Dra. Emma Cantos-Villar, quienes obtuvieron y caracterizaron dos extractos procedentes de subproductos de la industria vitivinícola, con una riqueza de 45.4% y 99% en estilbenos, con el fin de utilizaros como sustitutos totales o parciales del SO2 en el vino. Para garantizar la seguridad de estos extractos se llevaron a cabo los ensayos recomendados por la EFSA, siendo el primer paso la realización de distintos ensayos in vitro. Además, también se estudiaron sus estilbenos mayoritarios (trans-ε-viniferina y trans-resveratrol) y su mezcla en la misma proporción que en el extracto de mayor riqueza (1:3.9) para comprender sus mecanismos de acción en más profundad. Esta evaluación se realizó teniendo en cuenta que la vía oral será la preferente para estos extractos puesto que la exposición ocurrirá a través del vino. Así pues, se escogieron dos líneas celulares del aparato digestivo: las células de hepatocarcinoma humano HepG2, ya que el hígado es el principal órgano de biotransformación, y las células de adenocarcinoma de colon humano Caco-2, por ser el intestino el órgano que se ocupa de la absorción y donde existe mayor tiempo de contacto con las sustancias ingeridas. En primer lugar, el estudio de los efectos de ambos extractos, sus compuestos mayoritarios y su mezcla se llevó a cabo mediante ensayos de citotoxicidad y análisis de la morfología celular. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron evaluando la afectación de tres biomarcadores (ensayo de la sal de tetrazolio (3- [4,5, dimetiltiazol-2-il]-5-[3-carboximetoxi-fenil]-2-[4-sulfofenil]-2H-tetrazolio) (MTS), ensayo del rojo neutro (RN) y contenido proteico (PT)) y nos permitieron conocer la concentración efectiva media (EC50) tras 24 y 48 h de exposición. Además, los efectos ultraestructurales causados en las células por estos compuestos se evaluaron observando su morfología. Los resultados obtenidos indicaron que ambos extractos y la mezcla de sus compuestos mayoritarios poseen una citotoxicidad parecida en ambas líneas celulares dando lugar a vacuolas de lípidos, núcleos apoptóticos y aberraciones mitóticas. Sin embargo, la trans-ε-viniferina produjo la muerte celular de manera más potente y a concentraciones más bajas que los demás compuestos ensayados. Por último, el trans-resveratrol tan sólo produjo una leve citotoxicidad tras 48 h de exposición. Por otro lado, una vez analizada la citotoxicidad y los cambios morfológicos producidos por estos compuestos, realizamos un estudio de isobologramas con el fin de conocer el tipo de interacción entre la trans-ε-viniferina y el trans-resveratrol. Según la bibliografía disponible, es la primera vez que se ha usado este ensayo para estudiar la interacción entre estos dos compuestos. Los resultados indicaron que estos compuestos presentan un efecto antagónico. Por otra parte, debido a que los estilbenos poseen una gran actividad antioxidante, se realizó un estudio del estrés oxidativo de las células HepG2 y Caco-2 tras la exposición de estos compuestos, ya que las sustancias antioxidantes pueden tener un carácter prooxidante dependiendo de la línea celular estudiada, concentración y condiciones de exposición. Para ello, evaluamos el contenido en especies reactivas de oxígeno (ERO) y el contenido en glutation (GSH) de ambas líneas celulares expuestas a ambos extractos, trans-ε-viniferina, trans-resveratrol y su mezcla. Además, para completar estos resultados, se estudió la capacidad de estos compuestos tanto para proteger como para revertir el daño producido por un agente oxidante. Los datos obtenidos en estos ensayos indican que ambos extractos, la trans-ε-viniferina y su mezcla con trans-resveratrol poseen interesante actividad antioxidante, mientras que el trans-resveratrol de manera individual no fue capaz de modular el estrés oxidativo en estas células. Esta batería de ensayos in vitro dio lugar a las siguientes publicaciones: • IN VITRO TOXICITY ASSESSMENT OF STILBENE EXTRACT FOR ITS POTENTIAL USE AS ANTIOXIDANT IN THE WINE INDUSTRY (Medrano-Padial et al., 2019; Antioxidants, 8, 467). RESUMEN TESEO • CYTOTOXICITY STUDIES OF A STILBENE EXTRACT AND ITS MAIN COMPONENTS INTENDED TO BE USED AS PRESERVATIVE IN THE WINE INDUSTRY (Medrano-Padial et al., 2020; Food Research International, 137, 109738). • PROTECTION AND REVERSION ROLE OF A PURE STILBENE EXTRACT FROM GRAPEVINE SHOOT AND ITS MAJOR COMPOUNDS AGAINST AN INDUCED OXIDATIVE STRESS (Medrano-Padial et al., 2020; Journal of Functional Foods (en revision). A continuación, siguiendo las recomendaciones de la EFSA para la evaluación de sustancias para su posible uso como aditivos, el siguiente paso es la realización de ensayos de mutagenicidad y genotoxicidad. Para ello, decidimos escoger el extracto con mayor riqueza en estilbenos (ST-99) ya que presentó el mejor perfil toxicológico y tecnológico. Además, se demostró que el uso de este extracto no modificó las propiedades sensoriales ni alteró la calidad del vino tinto. Los ensayos recomendamos por la EFSA son dos: el test de Ames y el ensayo de micronúcleos (MN). En el test de Ames evaluamos el potencial mutagénico del extracto en cinco cepas de Salmonella typhimurium en concentraciones desde 48 a 5000 μg/placa. En este ensayo, no se observaron diferencias significativas a ninguna de las concentraciones ensayadas, en presencia o en ausencia de la fracción microsómica S9. Por otro lado, el ensayo de MN en células L5178Y TK+/- nos permitió conocer el potencial de este extracto para producir MN que contengan fragmentos o cromosomas enteros. Los resultados indicaron que en ausencia de S9 ninguna de las concentraciones del extracto ST-99 ensayadas (4-64 μg/mL) produjo un aumento en la frecuencia de células binucleadas con MN (CBMN). Sin embargo, sí se observó un aumento de CBMN en presencia de S9 después de la exposición a la concentración más alta estudiada (3.45-60 μg/mL). Para completar esta evaluación, decidimos realizar el ensayo cometa estándar y modificado con la enzima formamidopirimidina glicosilasa (FPG). Esta técnica nos permitió conocer que el extracto ST-99 no produce rotura directa de la hebra de ADN ni oxidación de las bases purinas. Además, evaluamos la capacidad del extracto para proteger y revertir el daño oxidativo producido en el ADN por H2O2 y Ro19-8022. Los resultados indican que este efecto fue contrarrestado a las concentraciones más altas ensayadas en las células HepG2 y Caco-2 (EC50). Los datos obtenidos en estos tres ensayados fueron incluidos en el siguiente trabajo: • MUTAGENIC AND GENOTOXIC POTENTIAL ASSESSMENT OF A PURE STILBENE EXTRACT BY IN VITRO STUDIES (Medrano-Padial et al., 2021. Food and Chemical toxicology (en revision). Posteriormente, teniendo en cuenta los resultados contradictorios de genotoxicidad del extracto ST-99 in vitro, siguiendo las recomendaciones de la EFSA, se procedió al estudio del potencial genotóxico in vivo del extracto. Para ello, realizamos un estudio combinando el ensayo de MN en médula ósea y el ensayo cometa en hígado, estómago y sangre, tanto estándar como modificado con las enzimas FPG y Endonucleasa III (Endo-III). Los resultados obtenidos indican que el extracto no causa rotura ni oxidación en el ADN en ninguno de los tejidos estudiados. Por otro lado, en el ensayo de MN, tanto la relación entre eritrocritos policromáticos y normocromáitcos como el número de MN en eritrocitos policromáticos fueron similares en las ratas control y las tratadas, indicando que nuestro extracto no produce daño a nivel de médula ósea. Además, para completar estos resultados, se realizó un estudio histopatológico de la afectación del hígado y estómago, indicándose que tan sólo a la concentración más alta ensayada, la cual es 100 veces superior a la dosis que llegaría al consumidor (360 μg/mL), se detectaron leves daños. Además, según las recomendaciones de la OCDE, la ausencia de toxicidad debe ser corroborada con algún método que confirme que los tejidos diana han sido expuestos a la sustancia de estudio (OCDE 474 y OCDE 489). Por ello, llevamos a cabo una cromatografía líquida de ultra alta presión acoplada a un espectrómetro de masas (UPLC-HESI-MS) como técnica para demostrar presencia de los estilbenos y sus derivados en muestras biológicas. Los resultados indican que tanto la trans-ε-viniferina como el trans-resveratrol y sus derivados están presentes en sangre. Estos datos se recogen en la siguiente publicación: • IN VIVO GENOTOXICITY OF STILBENE EXTRACT INTENDED TO BE USED AS NATURAL ADDITIVE: A COMBINATION OF THE MICRONUCLEUS TEST AND THE COMET ASSAY (título provisional).

Premio Extraordinario de Doctorado US