Impacts of oomycete mycelia and zoospores in bioremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons

Con el objetivo de evaluar el papel de los oomicetos en la biorremediación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), exploramos en esta tesis las interacciones funcionales entre estos microorganismos y las bacterias degradadoras de HAPs. Estas interacciones se estudiaron en dos diferentes modos del desarrollo de los oomicetos: micelios y zoosporas. La primera parte de esta tesis se centró en la interacción ecológica entre el oomiceto del suelo Pythium aphanidermatum y dos bacterias representativas degradadoras de HAPs (Mycobacterium gilvum VM552 y Pseudomonas putida G7). Elegimos una serie de compuestos químicos para imitar escenarios de contaminación por HAPs, que incluían disoluciones acuosas con carbono orgánico de origen diverso (exudados radicales de plantas y ácidos húmicos) y disolventes orgánicos. El micelio del oomiceto y ambas bacterias no actuaron de forma antagonista durante el crecimiento en medio sólido. Sólo a la densidad más alta de células bacterianas (10^8-10^10 células/mL) ambas bacterias disminuyeron la formación de zoosporas. M. gilvum VM552 mostró el mayor antagonismo. Se observó una influencia negativa de los HAPs sobre la formación y la quimiotaxis de zoosporas cuando se expuso los productos químicos desde soluciones de carbono orgánico disuelto (COD) y disolventes polares, pero esta influencia fué disminuida por las bacterias. Cuando los HAPs fueron expuestos a partir de disolventes no polares, que formaban una fase diferenciada con el agua (o líquido en fase no acuosa ¿ NAPL), no impidieron el asentamiento de las zoosporas sobre estos sustratos. El asentamiento se produjo en la interfase con hexadecano (HD) como NAPL, pero no con heptametilnonano, y no fue influido por las bacterias degradadoras de HAPs. También se observó que las zoosporas se enquistaron sobre la interfase agua-HD, creando una red de micelio que colonizaba la interfase, expandiendo el área interfásica entre el NAPL y la fase acuosa. Dicha red inició la formación de un biofilm por los consorcios microbianos compuestos por el oomiceto y las bacterias degradadoras de HAPs. En base a estos resultados, sugerimos que los micelios y las zoosporas del oomiceto fueron capaces de desarrollarse en en escenarios de contaminación por HAPs, y que fueron influidos por la biodisponibilidad de los contaminantes y por las interacciones con las bacterias degradadoras de HAPs. Para continuar nuestra investigación sobre las interacciones oomiceto/bacterias en el contexto de la biorremediación de HAPs, exploramos, en la segunda parte de esta tesis, la influencia de micelios de dos oomicetos (Py. aphanidermatum y Pythium oligandrum) sobre la biodegradación de HAPs por M. gilvum VM552. Los experimentos se diseñaron para crear restricciones de biodisponibilidad a través de la asociación de los HAPs con un NAPL, que estaba constituido por una mezcla de fuel pesado y HMN. Se utilizaron dos sistemas experimentales, uno bajo condiciones de aireación (mediante agitación orbital continua a 80 rpm), y el otro bajo condiciones estáticas. La biodegradación se estimó de forma continua a través de la producción de 14CO2 a partir de fenantreno marcado con 14C, y mediante la determinación de las concentraciones finales de HAPs y alcanos presentes en el NAPL con CG/EM. Observamos que, en condiciones de agitación, ambos oomicetos aumentaron la tasa de mineralización de fenantreno (5.86-8.27 ng/mL/h) por la bacteria. Se observó una tendencia similar en la mineralización bajo condiciones estáticas, aunque las fases de aclimatación fueron más largas que bajo agitación continua. Las tasa alta de mineralización se correspondió con la formación de densos biofilms microbianos sobre la interfase agua/NAPL. En ausencia de oomicetos, la mineralización de fenantreno fue lenta y lineal. El exceso de COD en la fase acuosa, producido mediante la adición de agar DV8 o de biomasa de oomiceto cultivado con agar DV8, también estimuló la biodegradación de HAPs, lo que sugiere que el crecimiento del oomiceto proporcionó nutrientes que se disolvieron pasivamente desde el medio sólido hacia la fase acuosa, lo cual estimuló la actividad metabólica de la bacteria. También proponemos que las diferencias en el contenido en biomasa y en la formación de zoosporas producidas por los diferentes oomicetos pueden también ser un mecanismo clave en la formación de biofilm o en la biodegradación de HAPs en la interfase NAPL/agua. Interesantemente, las condiciones estáticas aumentaron la tasa de mineralización de fenantreno en ausencia de suplementos, lo que indicó que la interferencia física causada por la aireación no sólo estabilizó la capacidad de biodegradación por la bacxteria, sino que también afectó el crecimiento bacteriano y la formación de biofilm en la interfase NAPL/agua. Para discriminar los efectos causados por las zoosporas de los causados directamente por los micelios, la tercera parte de esta tesis examinó el posible papel del comportamiento de natación de las zoosporas en la movilización de bacterias degradadoras de HAPs. Durante la coexistencia de zoosporas y bacterias en presencia de un atrayente de zoosporas (5 % (v/v) de etanol) se observó la movilización bacteriana por el comportamiento quimiotáctico de las zoosporas. Observamos que las células (no flageladas) de M. gilvum VM552 y células en fase estacionaria de P. putida G7, que exhibían un bajo nivel de movilidad, fueron movilizadas por las zoosporas a tasas de 22 a 24 células/uL/s. Estas tasas resultaron en unas velocidades de flujo de biomasa de 25,85 a 68,38 um/s, que fueron superiores a la velocidad de flujo espontáneo (19,51 um/s). En ausencia del atrayente, las zoosporas mostraron cuatro patrones típicos de natación (lineal, circular, de onda sinusoidal y estilo libre). El enquistamiento de las zoosporas fue a menudo precedido por el modo de movimiento circular. En presencia de células de M. gilvum VM552, la tasa de cambio de dirección (RCDI) en las trayectorias de las zoosporas descendió de forma significativa, y se aumentó el movimiento circular. Las células de P. putida G7 en fase exponencial (altamente móviles) y en fase estacionaria no causaron ningún cambio en el comportamiento de natación de las zoosporas, aunque éstas sí causaron un aumento de RCDI en el patrón de natación de la bacteria. Además, no se observó la adhesión entre zoosporas y bacterias ni la quimiotaxis bacteriana hacia zoosporas enquistadas. Proponemos dos posibles mecanismos clave para la biomovilización, incluyendo la advección directa causada por la quimiotaxis de las zoosporas y los flujos de torbellino a través del movimiento circular de zoosporas. El tamaño y la motilidad bacteriana afectaron estos mecanismos, ya que las células en fase estacionaria (más pequeñas y menos móviles que las células en fase exponencial) se movilizaron de manera más eficaz. Con estos resultados, se concluye que el comportamiento quimiotáctico de las zoosporas puede mejorar la movilización de bacterias mediante la modificación de la actividad hidráulica del microambiente acuoso. Concluímos que los oomicetos proporcionan nuevas perspectivas en las estrategias biotecnológicas para la mejora de la biorremediación. Los oomicetos mostraron una fuerte subsistencia en situaciones de contaminación por HAPs, y sus zoosporas y micelios pueden aumentar, a través de mecanismos diferentes, la biodisponibilidad de los HAP. Los mecanismos de esta mejora fueron posibles por el estilo de vida ecológico de los oomicetos. Las zoosporas actuaron como bio-vectores para facilitar la movilización microbiana, lo cual puede proporcionar una expansión de red micelial y así promover la formación de biopelículas y la biodegradación en interfases de microambientes contaminados por HAPs.