Evaluación de la actividad antifúngica de péptidos sintéticos derivados de Lactoferricina Bovina solos o en combinación con extractos de Bidens pilosa : un acercamiento al mecanismo de acción | Evaluation of the antifungal activity of synthetic peptides derived from Bovine Lactoferricin alone or in combination with Bidens pilosa extracts : an approach to the mechanism of action

Péptidos antimicrobianos (PAMs) y metabolitos de extractos vegetales son productos naturales (PNs) generados por los organismos para su defensa frente a los patógenos. Péptidos cortos derivados de Lactoferricina Bovina (LfcinB) y extractos de la planta Bidens pilosa, han presentado actividad contra diferentes microorganismos, entre ellos, Candida spp. Esto es relevante para el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de enfermedades causadas por Candida spp., que se han incrementado debido al aumento de la población nmunocomprometida, escasez de antifúngicos, toxicidad y resistencia. Según lo anterior, péptidos de LfcinB y extractos de B. pilosa, pueden ser potencialmente activos para el ratamiento de infecciones ocasionadas por estas levaduras; sin embargo, el empleo de PNs en el ámbito terapéutico ha sido un reto debido a inconvenientes como: estabilidad, citotoxicidad y altos costos; para solventar estas limitaciones y potenciar la actividad, se han utilizado estrategias como, modificar químicamente los PNs y explorar el uso de terapias combinadas. En el presente trabajo se evaluó la actividad antifúngica, posible mecanismo de acción y efecto citotóxico de péptidos sintéticos derivados de LfcinB y/o extractos de B. pilosa. Para esto el trabajo se desarrolló en tres etapas: Etapa I: tamizaje de actividad antifúngica del péptido R-1-R: RWQWRWQWR, 20 péptidos análogos y 3 extractos de B. pilosa contra C. albicans SC5314 y 256, y C. auris 435 y 537. Los resultados muestran que el péptido R-1-R y un extracto etanólico de hojas de B. pilosa, presentaron la mayor actividad antifúngica, con Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMIs) entre 100 y 200 μg/mL para el péptido y 500 μg/mL para el extracto. Además, se observó un efecto fungistático y fungicida dependiente de la concentración en ambos casos. En la Etapa II: El péptido R-1-R y el extracto etanólico de B. pilosa fueron evaluados en combinaciones entre sí o con fluconazol (FLC); la mejor actividad se observó cuando se combinó el péptido y el extracto, obteniendo . efecto sinérgico en la actividad contra C. albicans SC5314, C. auris 435 y C. auris 537 y efecto aditivo contra y C. albicans 256 En la Etapa III, se estableció que la actividad antifúngica del péptido R-1-R, el extracto de B. pilosa y la combinación de estos contra cepas de C. albicans, sensible y resistente a FLC, puede estar asociada a afectación de la superficie celular, transportadores de membrana, cadena respiratoria y polarización de membrana mitocondrial, que sugieren muerte celular por apoptosis, lo que fue respaldado por, microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM), al observar la presencia de microcuerpos citoplasmáticos. Mediante STEM, también se observó citoplasmas desorganizados después de la incubación con péptido, extracto y combinación, lo que ha sido correlacionado con muerte celular por necrosis. Los resultados de microscopía variaron acorde a la especie y las concentraciones de los tratamientos usadas. El efecto hemolítico del péptido, el extracto y su combinación, fue dependiente de la concentración y se observó baja citotoxicidad en eritrocitos y fibroblastos. Finalmente, en el modelo in vivo de Galleria mellonella, al igual que en el modelo in vitro, la toxicidad disminuyó cuando el péptido y el extracto fueron combinados y además se observó dependencia con la forma de administración de los tratamientos. Los resultados sugieren que la combinación del péptido R-1-R y el extracto etanólico de hojas de B. pilosa, es una estrategia eficaz para potenciar la actividad antifúngica contra C. albicans y C. auris sensibles y resistentes a antifúngicos. Además, la combinación péptido- extracto fue menos tóxica en eritrocitos, fibroblastos humanos y G. mellonella, que el péptido o el extracto solos. De manera preliminar se estudió el modo de acción del péptido R-1-R, extracto y su combinación, utilizando diferentes técnicas. Los resultados indican que la combinación de PNs y agentes antifúngicos comerciales puede ser considera una alternativa terapéutica prometedora para el tratamiento de enfermedades causadas por Candida spp.

Antimicrobial peptides (AMPs) and metabolites from plant extracts are natural products (NPs) generated by organisms for their defense against pathogens. Short peptides derived from Bovine Lactoferricin (LfcinB) and extracts from the Bidens pilosa plant have shown activity against different microorganisms, including Candida spp. This is relevant for the development of new drugs for the treatment of diseases caused by Candida spp., which have increased due o the increase in the immunocompromised population, shortage of antifungals, toxicity and resistance. According to the above, LfcinB peptides and B. pilosa extracts may be potential active ingredients for the treatment of infections caused by these yeasts; However, the use of PNs in the therapeutic field has been a challenge, due to drawbacks such as: stability, cytotoxicity and high costs; to overcome these limitations and enhance activity, strategies have been used such as chemically modifying PNs and exploring the use of combined therapies. In the current work, the antifungal activity, possible mechanism of action and cytotoxic effect of synthetic peptides derived from LfcinB and/or B. pilosa extracts were evaluated. For his, the work was carried out in three stages: Stage I: screening of antifungal activity of the peptide R-1-R: RWQWRWQWR, 20 peptides and 3 extracts of B. pilosa against C. albicans SC5314 and 256, and C. auris 435 and 537. The results show that the R-1-R peptide and an ethanolic extract of B. pilosa leaves presented the highest antifungal activity, with Minimum Inhibitory Concentrations (MICs) between 100 and 200 μg/mL for the peptide and 500 μg /mL for the extract. Furthermore, a concentration-dependent fungistatic and fungicidal effect will be observed in both cases. In Stage II: The R-1-R peptide and the ethanolic extract of B. pilosa were evaluated in combinations with each other or with fluconazole (FLC); the best activity will be observed when the peptide and the extract are combined, obtaining synergistic effect on activity against C. albicans SC5314, C. auris 435 and C. auris 537 and additive effect against and C. albicans 256. In Stage III, it was established that the antifungal activity of the R-1-R peptide, the B. pilosa extract and the combination of these against strains of C. albicans, sensitive and resistant to FLC, may be associated with affectation of the cell surface, membrane transporters, respiratory chain and mitochondrial membrane polarization, suggesting cell death by apoptosis, which was supported by scanning transmission electron microscopy (STEM), observing the presence of cytoplasmic microbodies. Using STEM, disorganized cytoplasm was also observed after incubation with peptide, extract and combination, which has been correlated with cell death due to necrosis. The microscopy results varied according to the species and the concentrations of the treatments used. The hemolytic effect of the peptide, the extract and its combination was concentration- dependent and low cytotoxicity was observed in erythrocytes and fibroblasts. Finally, in the Galleria mellonella in vivo model, as in the in vitro model, toxicity decreased when the peptide and the extract were combined and dependence on the way of administration of the treatments was also observed. The results suggest that the combination of the R-1-R peptide and the ethanolic extract of B. pilosa leaves is an effective strategy to enhance antifungal activity against C. albicans and C. auris sensitive and resistant to antifungals. Furthermore, the peptide-extract combination was less toxic in erythrocytes, human fibroblasts and G. mellonella than the peptide or the extract alone. Preliminarily, the mode of action of the R-1-R peptide, extract and its combination was studied using different techniques. The results indicate that the combination of PN and commercial antifungal agents can be considered a promising therapeutic alternative for the treatment of diseases caused by Candida spp.

Doctor en Ciencias Biológicas

Doctorado

orcid.org/0000-0003-4788-8150

https://scholar.google.com/citations?user=gWCFBUoAAAAJ&hl=es

https://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=0001446129