Actividad de la MAPK, organización del huso mitótico y condensación de los cromosomas en ovocitos de moluscos después de la criopreservación | The mapk activity, mitotic spindle satus, and chromosome condensation from mollusc oocytes after cryopreservation

Muchos protocolos para la criopreservación de ovocitos necesitan ser optimizados debido a su complejidad celular. Para ello, entender el daño producido por la criopreservación en los ovocitos es de suma importancia. El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la criopreservación en la actividad de la proteína MAPK, la evaluación de los microtúbulos y el estado de los cromosomas en ovocitos de ostión del Pacífico, Crassostrea gigas, y del abulón rojo, Haliotis rufescens, criopreservados bajo diferentes condiciones. Ovocitos de ostión fueron obtenidos directamente de la gónada y, previa selección del mejor crioprotector, se suspendieron alícuotas en etilen glicol (EG) 10%, sacarosa (S) 0.25M y la mezcla EG10% y S 0.25M para ser congeladas en popotes franceses (0.25 mL) de acuerdo a las especificaciones de Tervit et al. 2005. Para los experimentos con abulón, las hembras fueron desovadas. Los ovocitos fueron incubados en trehalosa (T) 0.2M o 0.4M por 20 min antes de ser colocados en popotes franceses de 0.25 mL y congelados con una tasa de congelación de tres pasos. El primer paso consistió en bajar la temperatura a 2°C/min hasta alcanzar los -8°C, inducir una nucleación por 10 min, continuar bajando la temperatura a 0.3°C/min hasta alcanzar los -30°C y terminar bajando la temperatura a 50°C/min hasta llegar a los -150°C. Los ovocitos de ambas especies fueron almacenados a -196°C. Para evaluar el daño debido a la criopreservación, muestras de cada especie y de los diferentes tratamientos fueron descongelados y alícuotas fueron preparadas para evaluar: la viabilidad por medio de una tinción fluorescente con FDA, el daño en los microtúbulos mediante inmunocitoquímica, condensación de cromosomas detectado por tinción fluorescente con DAPI, la actividad de la proteína MAPK utilizando la técnica de Western blot y la capacidad de los ovocitos descongelados para ser fertilizados. Los resultados indicaron que no hubo diferencias significativas (P > 0.05) en la viabilidad o la producción de larvas trocóforas de los ovocitos de ostión congelados en EG10% o la mezcla. El mayor porcentaje de husos no organizados (100%) fue encontrado en las muestras congeladas en S0.25M y la mezcla EG10% y S0.25M. Se encontraron diferencias significativas (P < 0.001) en la descondensación de los cromosomas. Comparado con el control, todos los tratamientos tuvieron < 26% de ovocitos no condensados. La actividad de la proteína MAPK no fue afectada por el proceso de criopreservación. En el caso de la incubación de los ovocitos de abulón en los diferentes tratamientos, se encontró que los mejores tratamientos para los ovocitos incubados fueron por 20 min en 0.2M de trehalosa (96 ± 1% de viabilidad) y para los ovocitos incubados por 10 min en 0.4 M de trehalosa (98 ± 1% de viabilidad). Los ovocitos descongelados de abulón no fueron viables. Este trabajo demostró que se pueden obtener larvas trocóforas de ostión viables y que el criodaño a nivel celular fue evitado. Sin embargo, más investigación es necesaria para la criopreservación de ovocitos de abulón rojo ya que se demostró un criodaño físico a nivel de membrana y ultraestructura.

The oocyte cryopreservation needs to be optimized due to their cellular complexity. Thus, to understand the cryoinjury produced in the oocytes at different levels is very important. The goal of this work was to determine the effect of the cryopreservation in the MAPK activity, the organization of microtubules and the state of chromosomes condensation in the oocytes of the Pacific oyster, Crassostrea gigas, and red abalone, Haliotis rufescens, using different conditions. The oyster oocytes were obtained from the gonad, and previous selection of the best cryoprotectant, the oocytes were cryopreserved in etilene glycol (EG) 10%, sucrose (S) 0.25M and its mixture (EG10% and S0.25M) in 0.25 mL French straws according to Tervit et al. 2005. Ripe abalones were induced to spawn. The oocytes were equilibrated in trehalose (T) 0.2M or 0.4M for 20 min before frozen in 0.25-mL French straws with a 3-step cooling rate. In the first step, the rate temperature was 2°C/min to -8°C. Nucleation was induced for 10 min at this temperature. In the next step the rate temperature was 0.3°C/min to -30°C. In the last step the rate temperature was 50°C/min to -150°C. Oocytes of the two species were stored in liquid nitrogen (-196°C). To evaluate the cryoinjury, samples of each species at the different treatments were thawed and aliquots were prepared to: evaluate the viability by fluorescent stain with FDA, assess the damage in the microtubules by inmunocytochemistry and chromosomes condensation by fluorescent stain with DAPI and evaluate the MAPK activity using Western blot and capacity of the thawed oocytes to be fertilized. The results indicated that the viability of thawed oocytes or production of trochophore larvae of oyster oocytes frozen in EG10% or in the mixture were not significant different (P > 0.05). The highest percentage of non mitotic spindles (100%) was found in the samples frozen in S0.25M and the mixture EG10% and S0.25M. Significant differences (P < 0.001) were found in the chromosomes condensation. Compared with the control, all the treatments had < 26% of non condensed chromosomes. The activity of MAPK was not affected by the cryopreservation. For oocytes of red abalone, the best incubation treatments were: 0.2M of trehalose (96 ± 1% of viability) equilibrated for 20 min and 0.4 M of trehalose (98 ± 1% of viability) equilibrated for 10 min. Thawed abalone oocytes were not viable. This work showed that it is possible to obtain viable oyster trochophore larvae and that the cryoinjury could be avoided. However, more research is needed to cryopreserve oocytes of red abalone since physical cryoinjury was detected in the membrane and at ultrastructure level.