A comparison of different orthogonal techniques for the investigation of the conformational stability of NIST mAb in liquid formulations

إنجليزي. A great challenge during early development of medicinal antibodies is to determine the stability of the candidates. This is required to be able to select the candidates with the greatest developability. The stability of the candidates can be estimated using different orthogonal techniques and the aim of this investigation was thus to use orthogonal techniques for the investigation of conformational changes and aggregation of mAbs. The secondary aim was to obtain information concerning the effect that formulation components has on the stability of NIST mAb and which techniques that detects which conformational changes. The stability will be estimated for NIST mAb in liquid formulations where the mAb concentration, buffer type, tonicity, pH and storage time is altered. Differential scanning calorimetry (DSC), dynamic and static light scattering (DLS & SLS), circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence are the methods used to estimate the stability in the different formulations. During the investigations it was noted that the instruments detect different conformational changes as they investigate different parts of the mAb and they received different peak temperatures of the conformational changes. Most instruments detect conformational changes in the span of 54-78°C. The order of the instruments that detected the first conformational change, from the lowest to the highest, was: DLS, CD, intrinsic fluorescence and DSC. Additionally, the effect of the addition of salt was investigated using the nanoDSC and the Zetasizer and it was noticed that it caused destabilization of the mAb in both cases. The effect of pH on the mAb was investigated using DSC, DLS, CD and fluorescence. The CD measurements shows a positive linear trend between stability and pH for the investigated solutions, and a slight wavelength shift was detected during the fluorescence measurements between pH 5.2 and 5.7. Yet, the trend was not as clear for the DSC and it was unclear if DLS could detect a stability change based on the received results. Lastly, there are no clear correlations between the buffer types and the mAb stability for any of the investigated methods. Thus, it can be concluded that the methods detect different formulation changes, yet it is difficult to determine which investigational method is the most applicable in early formulation development

السويدية. Antikroppar har ett brett användningsområde med stor potential men det är svårt att skapa stabila lösningar. Den strukturella stabiliteten är en viktig faktor när man väljer läkemedelskandidater, och i de tidiga utvecklingsstadierna görs prediktiva undersökningar för att ta reda på varje kandidats stabilitet och utvecklings-potential. Därmed är det av största intresse att utvärdera hur antikroppars stabilitet påverkas av olika vätskeformuleringar och hur de prediktiva undersökningar utvärderar stabiliteten. Användandet av antikroppar i läkemedelsbehandlingar har öppnat upp fantastiska möjligheter för att bota en bred variation av sjukdomar som antingen ej tidigare kunnat behandlats eller där de tidigare behandlingarna haft kraftiga biverkningar. Därmed har antikroppar en ljus framtid på läkemedels-marknaden och antalet godkända antikroppar har ökat stadigt under de senaste årtiondena. Det finns emellertid vissa svårigheter när det kommer till läkemedelsutvecklingen av antikroppar och ett stort hinder är antikropparnas stabilitet. En stabil antikropp krävs för att man ska kunna tillverka och transportera medicinen till patienten och det finns olika lösningar för att öka stabiliteten. Man kan till exempel tillsätta olika stabilisatorer till vätskelösningen som undersöker vilka stabilisatorer som passar den valda antikroppen så måste man bestämma vilken kandidat som har störst utvecklingspotential. Detta görs i ett tidigt stadie då man endast har en begränsad mängd av de olika kandidaterna och därmed görs prediktiva undersökningar för att ta reda på varje En antikropps stabilitet kan delas upp i två huvudgrupper, nämligen den fysiska och den kemiska stabiliteten, och denna text har fokuserat på en antikropps aggregationskänslighet i olika vätskelösningar. Det tillhör den fysiska stabiliteten och innebär att man undersöker hur lätt antikropparna i lösningen klumpar ihop sig med varandra och därmed ändrar form och möjligtvis tappar sin medicinska funktion. En schematisk bild av en antikropp kan ses i Figur 1 nedan och från den kan man se att den består av två lätta och två tunga kedjor. Man kan även se att antikroppen delas upp i två regioner, en som heter Fab och en som heter Fc. Fab regionen är den region som binder sig fast till patogenen eller smittämnet och Fc regionen binder till andra immunceller som tar hand om smittämnet. Figur 1. En schematisk representation av en antikropp där Fab och Fc regionerna är synliga. De tunga kedjorna är mörkblå och de lätta kedjorna är ljusblå. Fc regionen består av en CH2 och en CH3 region. En metod som heter differentiell svepkalorimetri (DSC) användes för att undersöka vid vilken temperatur Fab och Fc regionen ändrade form och det visade sig att antikroppar i en vätskelösning med bordssalt ändrade form vid än lägre temperatur än en lösning utan salt. Detta visar att salt i detta fall hade en negativ inverkan på antikroppens stabilitet. Lösningar med två olika typer av buffrar och tre olika pH-värden undersöktes även, men en lika tydlig trend som med saltet kunde inte ses. Det resonerades därmed att man möjligtvis kunde ändra dessa två förhållande beroende vilken region som var mest känslig för den valda antikroppen. En annan metod som heter dynamisk ljusspridning (DLS) användes för att undersöka vid vilken temperatur antikropparna började återfanns samma stabilitetstrend mellan salthalt och stabilitet som i DSCn. Emellertid återficks inga tydliga och entydiga svar mellan stabiliteten och lösningens pH, buffer eller förvaringstiden i kylskåp. En möjlig orsak till de tvetydiga resultaten kan bero på att metoden är aggregationskänslig och att mätcellen troligtvis blev smutsig under undersökningarna vilket skulle ha en inverkan på mätresultaten. Cirkulär dikroism (CD) är en tredje metod som användes för att komplettera undersökningsmetoderna och den kan mäta vilken 3D-struktur antikroppen har vid olika temperaturer. Dessa mätningar visade att antikroppen ändrade struktur vid en högre temperatur då lösningen hade ett högre pH. Dessutom tydde resultaten på att lösningens pH hade en inverkan på vilka delar av antikroppen som ändrade form. De två sista metoderna som undersöktes var statisk ljusspridning (SLS) och fluorescence. SLS liknar DLS och mäter också partikelstorleken men på ett lite annorlunda sätt. Emellertid kunde man inte se någon aggregation under de mätningarna, vilket möjligtvis kunde bero på att koncentrationen var för låg för att mäter ljusmängden som emitteras från fluorescerande delar av antikroppen och i detta fall undersöktes ljuset som emitterades från tryptofan, som är en aminosyra. Detta kan ge information om strukturförändringar och undersökningsresultaten tydde på att det skedde en strukturell föränding vid 64°C. Sammanfattningsvis, konstaterades det att metoderna som undersöktes kan användas för att bestämma en antikropps stabilitet i olika vätske-formuleringar, och att de strukturförändingarna som uppmättes skedde efter ca 58°C. Dessutom bekräftades det att salt har en negativ inverkan på korttidsstabiliteten av en antikropp och att korrelationen mellan en antikropps stabilitet och lösningens pH eller buffer är mer komplex. Slutligen kan man säga att läkemedelsindustrin har löst många av de stabilitetsutmaningar som proteinläkemedel har frambringat, och att antikroppar kommer vara den läkemedelstypen som leder oss in i en ny medicinsk era.