Sperma kasutus meemesilastel: Spermatosoidide loendus viljastatud munarakkudel ema viljakuse mõõtmiseks

Meemesilastel (Apis mellifera) on ühe pere kohta vaid üks viljastumisvõimeline emane ning mitu isast, kelle ainsaks ülesandeks elus on tagada oma päriliku materjali edasi andmine ehk ema viljastamine. Ema paaritub reeglina vaid kord elus paaritumislennu ajal, kus teda viljastab keskmiselt 12 isast. Isased surevad peale suguühet, kuna paaritumise tagajärjel rebeneb nende suguelund nende küljest, jäädes ajutiselt emamesilasse. Isased kukuvad paralüseeritult maha surema. Ema kogub esialgse isastelt saadud sperma mahu esmastesse suguteedesse, millest jõuab lõppkokkuvõttes spermapauna kokku vaid väike osa. Spermapaun on organ, kus hoiustatakse elujõulist spermat ema paaritumise ning muna viljastamise vaehpealsel ajaetapil. Munarakkude viljastamine toimub ema siseselt, munedes aastas ligi 200 000 viljastatud muna. Kuna ema paaritub vaid korra oma elu alguses, tuleb tal tagada spermapaunas hoiustatava sperma elujõulisus kuni aastateks. Sperma jaotus munarakkudele kogu ema elu vältel on mõjutatud kahest limiteerivast tegurist, millest sõltuvalt optimeerib ema spermatosoidide arvu, mida ta kasutab muna raku viljastamiseks. Esiteks, kuna pere üheks oluliseks tugevuse näitajaks on toodetud tööliste arv, peab ema optimeerima kasutatud spermatosoidide arvu nii, et tööliste toodag oleks tagatud ka ema kõrgemas eas. See eeldab spermatosoidide võimalikult madalarvulist kasutamist. Samas on täheldatud sperma kvaliteedi langust paralleelselt ema vanuse suurenemisega, mistõttu peab ema viima spermatosoidide arvu piisavalt kõrgele, et tagada viljastumise efektiivsus. Kui ema ei suuda enam läbi viljastatud munade munemise toota piisavalt töölisi, asendatakse ta pere poolt uue, tõenäoliselt efektiivsema emaga. Seetõttu on oluline, et ema sperma kasutus oleks optimaalne, et tagada ühelt poolt pikk vijastumisiga ning teiselt poolt kasutada piisavalt palju spermatosoide, et tagada munarakkude efektiivne viljastamine igas ajahetkes. 2 Seniajani ei oldud viidud läbi uuringut, mis võimaldaks täpse, värskelt viljastatud munarakul oleva spermatosoidide arvu kindlaks tegemist. Kogutud andmed sperma kasutuse kohta olid saadud vaid läbi kaudsete arvutuste, jagades kogu spermapaunas oleva sperma arvu toodetud tööliste arvuga. Sellisel meetodil saadud spermatosoidide arv varieerus 4-100 spermatosoidini, olles äärmiselt umbkaudne hinnang. Sperma kasutuse uurimise olulisus lasub peamiselt kahel eri suunitlusega alal. Esiteks omavad tulemused suurt rolli mesilaste reproduktiivsussüsteemide mõistmisel arengubioloogia vallas, aidates vastata küsimustele eri organite funktsioonide koha pealt seoses sperma kasutusega emas. Teisalt saavad tulemustest kasu ka need mesinikud, kes tegelevad intensiivsema mesindusega, kus emasid peredes vahetatakse enneaegselt emade loomulikku surma. Mainitud käitumise üheks põhjuseks on uskumus, et vanemad emad ei suuda tagada pere tugevust läbi piisava arvu tööliste tootmise, kuna nende spermapaun võib elujõulisest seemnest tühi olla. Käesoleva töö esmaseks eesmärgiks oli kohandada ning praktikasse panna uuringu põhimeetod spermatosoidide visualiseerimiseks värskelt munetud munadel meemesilastes. Meetod on välja töötatud CIBER (Centre of Integrative Bee Research) grupi liikmete Susanne den Boer ning Boris Baer poolt, kes kasutasid seda efektiivselt esialgselt sipelgaliigi Atta colombica peal. Uuringu uudsus seisneb meetodi esmakordses kasutamises meemesilases. Meetodi unikaalsus ning lihtsus peitub fluoretsents värvi kasutuses, kus terve muna katmisel kõnealuse värviga on võimalik esile tuua vaid DNA pärilikku materjali sisaldavad elemendid ehk spermatosoidide pead. Olemasolul värvub ka juba arenguteed alustav sügoot. Käesoleva töö keskne uurimisala on sperma kasutuse muutused, mida vaadeldakse mõjutatuna eri teguritest. Antud juhul on peamiseks mõjuatatvaks faktoriks ema vanus (seprma kasutuse muutused vastavalt eri vanuselistele emadele), kuid vaadeldakse ka sperma kasutuse (viljastamisel munarakuga) seost sperma elujõulisusega spermapaunas peale ema lahkamist ning spermatosoidide koguarvu mõju spermapaunas (leitud peale 3 emade lahkamist) sperma kasutusele. Peamise hüpoteesina väidetakse antud uurimistöös, et sperma kasutus on erivanuselistes emades erinev, kus spermatosoidide arv munaraku viljastamiseks väheneb ema vanuse suurenedes. Teiseks, väidetakse antud uurimistöös, et sperma kasutus on erinev erinevate sperma koguste juures spermapaunas, kus spermatosoidide arv munaraku viljastamiseks suureneb spermatosoidide arvu kõrgenemisega spermapaunas. Töö läbivateks etappideks on: 1) tarude ettevalmistus; 2) värskelt munetud munade korje läbi kahe projekti, kokku ligikaudu 13 kuud; 3) spermatosoidide loendus värskelt munatud munadel; 4) emade lahkamine ning spermapaunade laboratoorne analüüs. Lisaks eelmainitule on teises projektis juures emade kunstlikult viljastamise etapp, mis hõlmab endas muuhulgas emade aretamist, isaste korjet, seemne korjet ning emade viljastamist laboratoorsetes tingimustes. Saadud andmed on analüüsitud statistilisi meetmeid kasutades. Esimeses uuringus vaadeldi ema vanuse mõju sperma kasutusele. Uurimisobjektideks olid 22 erivanuselist ema, kelle sperma kasutust varieeruvatel aegadel aasta jooksul mõõdeti. Teises uuringus kasutati lõpptulemusena 15 kunstlikult viljastatud ema, kus kaheksa ema viljastati kunstlikult 12 μl vastselt enne viljastamist kogutud sperma kogusega ning seitse 3 μl sperma kogusega. Nii esimeses kui teises uuringus oli vaatluse all sperma kasutuse mõjutatus munaraku viljastamisel sperma kogusest spermapaunas ning sperma elujõulisusest spermapaunas, mõõdetuna peale emade lahkamist. Tulemustena saadi positiivne kinnitus püstitatud hüpoteesile, kus sperma kasutus langes ema vanuse tõusmisel (r = -0.529, n = 28, p = 0.004). Kasutatud spermatosoidide mediaaniks 1-3 kuu vanuselistes emades on 7-9 spermatosoidi muna kohta, langedes järsult 4 spermatosoidini nelja kuulistes emades ning taandudes juba 7-kuulistes emades 1-2 spermatosoidini muna kohta, püsides sellisel tasemel ka vanimates emades, kelle sperma kasutust antud uuringus mõõdeti (28 kuud). Üldine mediaan on 2 spermatosoidi muna kohta vaadelduna üle kõigi emade. Erivanuselistes emades leiti spermapaunas oleva sperma elujõulisuse oluline mõju sperma kasutusele (r=0.773, n=14, p=0.001) näidates, et mida suurem on sperma elujõulisus seda 4 kõrgem on omakorda sperma kasutus munaraku viljastamisel. Kunstlikult viljastatud emades mõjutas sperma elujõulisus oluliselt vaid nende emade sperma viljastamiskasutust, keda oli eelnevalt seemendatud suurema spermakogusega (12 μl). Saadud spermatosoidide arvukuse mõju spermapaunas sperma kasutusele munaraku viljastamisel kinnitas samuti püstitatud hüpoteesi, kus on näha, et mida kõrgem on sperma arvukus spermapaunas (peale emade lahkamist), seda rohkem spermatosoide kasutavad emad munaraku viljastamiseks. Antud tugevat korrelatsiooni oli näha nii loomulikul teel paaritunud emades (r=0.609, n=14, p=0.021) kui ka kunstlikul teel viljastatud emades (r=0.611, n=14, p=0.020). Keskmised spermatosoidide arvukused spermapaunades olid: 1-2 kuu vanuselistes emades 3 549 750 spermatosoidi; 18-28 kuu vanuselistes emades 511 200 spermatosoini keskmiselt. Kunstlikult viljastatud emades olid keskmised spermatosoidide arvukused spermapaunades järgnevad: emades, kes olid viljastatud 3 μl seemne kogusega oli spermatosoidide arv spermapaunas 1 076 907 ning 12 μl seemendamiskogusega emades vastavalt 2 747 187 spermatosoidi. Ema vanuse mõju spermatosoidide elujõulisusele oli oluline (r=-0.767, n=14, p < 0.001) näidates, et mida vanem on ema, seda madalam elujõulisus spermal on. Vanuse mõju spermatosoidide arvule sperma paunas oli langeva iseloomuga (N =505, Pearson correlation=-0.71, p<0,01) – mida vanem ema, seda vähem spermat paunas, kus keskmine sperma kogus oli suurim1 kuulistes emades 5.56 miljonist isendiga ning madalaim 10-28 kuulistes emades, kus spermatosoidide arvuks oli ligikaudu 56 050– 890 000 isendit. Viimaks testiti kolme põhifaktori mõju sperma kasutusele munaraku viljastamisel (ema vanus, spermatosoidide arv ning elujõulisus spermapaunas) küsides, milline mõõdetud faktoritest omab suurimat mõju sperma kasutusele. Selgus, et suurimaks sperma kasutuse mõjuteguriks on emade vanus. 5 Saadud tulemused toetavad 1970. aastate lõpus tõstatatud teooriat, kus väidetakse, et spermatosoidide konsentratsioon spermapauna vedelikus kahaneb aja jooksul ning tulemuslikult mõjutab seega spermatosoidide arvu munaraku viljastamisel aja jooksul. Kuigi seniajani ei ole tõestatud, kas spermapauna vedelik on tegelikult konstantne läbi aja, on antud uurimuse tulemustest näha, et sperma kasutus kahaneb ema vanuse kahanedes. 1970ndatel tõstatatud teooriat toetab ka antud uuringus saadud sperma kasutamise languse järsk muutus peale 3-4ndat elukuud. Vaadates näiteks antud uuringu tulemusi näeme, et emad kasutasid kuni 3-4 elukuuni suhteliselt suurt kogust spermatosoide munaraku viljastamiseks ning siis optimeerisid sperma kasutuse järsult 1-2 spermatosoidi peale. Antud tulemused ei ole kasulikud mitte ainult mesilasbioloogia paremaks arusaamiseks vaid ka mesinikele, kellel üheks olulisemaks faktoriks mesilate tugevuse tagamisel on efektiivne, viljakas emamesilane. Teades, et 28-kuudes emades (antud emad on aasta-ringselt aktiivsed ning nende metabolism on liirem kui Eestis kasutatavad emad) on sperma paunas hoitava sperma kogus ligikaudu 500 000 spermatosoidi ning teades, et emad kasutavad keskmiselt 2 spermatosoidi munaraku kohta, saame umbkaudselt arvutada, et 28 kuused emad suudaksid veel viljastada ligi 250 000 munarakku eeldades, et spermapaunas hoisustatud sperma on 100% elujõuline. Kuna antud uurimuses saime teada, et 28 kuustes emades on sperma elujõulisus ligi 25%, siis saame arvutustest teada, et emad on tõenäoliselt võimelised viljastama ligikaudu 62 500 munarakku.

Honey bee (Apis mellifera) colonies are headed by a single reproductive female. This queen mates just once in her life with 12 males on average. The sperm is then stored in her spermatheca and used for egg fertilization throughout a queen’s life. The central aim of the current thesis is to investigate sperm use patterns in honey bee queens and the possible factors influencing it: queen’s age, sperm viability and sperm number in the spermatheca. To compare the effects of aforementioned factors two projects were conducted. The main technique used in both projects, was a method developed to directly visualize sperm present on freshly laid eggs using a fluorescent dye and microscope. In the first project 22 naturally mated queens of different ages were examined. In the second project two groups of virgin queens were artificially inseminated with different volumes of semen. The results showed that young queens use more sperm when fertilizing an egg than older queens (amounts being 7-9 sperm in 1-4 months old and 1-2 in 7-28 months old queens). The results also showed that in general younger queens have higher sperm viability in their spermatheca and also the total number of sperm is higher. All of these factors seem to affect sperm use, but queen age seems to be the most important determinant. The results of this thesis benefit the overall basic understanding of the honeybee biology and therefore social insects in general. Furthermore, with actual numbers on sperm use it gives the beekeepers a better insight to the factors that influence queen fertility and which might be of importance for managing hives.