La cisteína y su contribución a diferentes procesos de señalización en Arabidopsis thaliana

Trabajo realizado para optar al grado de Doctora en Bioquímica por la Licenciada Consolación älvarez Nuñez, Sevilla 2011

La cisteína es la primera molécula sintetizada en plantas que contiene azufre reducido y ocupa una posición central en el metabolismo debido a sus funciones bioquímicas. Las células de Arabidopsis thaliana contienen diferentes enzimas OAcetilserina( tiol)liasas (OASTL) que catalizan la biosíntesis de cisteína y están localizadas en el citosol, plastidios y mitocondrias, para dar lugar a múltiples conjuntos subcelulares de cisteína. Se ha avanzado mucho en el estudio de las OASTLs más abundantes, sin embargo, hasta ahora, la información sobre las menos abundantes es escasa. En el primer capítulo de esta tesis se establece la reacción enzimática catalizada por la isoforma minoritaria citosólica OASTL CS-LIKE (AT5G28030). Para ello, expresamos esta enzima en bacterias y caracterizamos la proteína recombinante purificada. Nuestros resultados demuestran que CS-LIKE cataliza la desulfuración de L-cisteína a sulfuro, amonio y piruvato. Por tanto, CS-LIKE es una nueva L-Cisteína desulfhidrasa localizada en el citoplasma y hemos propuesto que se designe DES1. El impacto y la funcionalidad de DES1 en el metabolismo de la cisteína se pone de manifiesto por el fenotipo de los mutantes insercionales de T-DNA des1-1 y des1-2. Los resultados obtenidos nos permiten proponer que DES1 es una L-Cisteína desulfhidrasa involucrada en mantener la homeostasis de cisteína en el citosol, principalmente durante los estadíos más tardíos del desarrollo o bajo perturbaciones ambientales. En el segundo capítulo de esta tesis se describe ampliamente el fenotipo de senescencia prematura de los mutantes des1, observándose un incremento de la expresión de los genes asociados a la senescencia, de otros marcadores como vacuolas asociadas a la senescencia (SAV) y una alteración del perfil transcripcional. Además se ha observado en ambos mutantes una clara inducción del proceso de autofagia mediante la acumulación de la proteína ATG8 y fundamentalmente de su forma conjugada. Puesto que la ausencia de DES1 en estos mutantes provoca una reducción en los niveles endógenos de sulfuro, hemos observado que tratamientos con H2S revierten la presencia de vacuolas asociadas a la senescencia, así como la inducción de la autofagia. Esta reversión de la autofagia por sulfuro se observa también en plantas sometidas a limitación por carbono. A nivel transcripcional también observamos que el sulfuro reduce considerablemente la alteración transcripcional de genes que muestra el mutante des1-1 en estadíos de crecimiento tardíos. Por tanto, proponemos que el H2S actúa como una molécula señalizadora que regula negativamente la autofagia y modula el perfil transcripcional en Arabidopsis.

En A. thaliana, la mayoría de la cisteína es sintetizada en el citosol por la acción de la isoforma mayoritaria citosólica OAS-A1. Por otra parte, la única cisteína desulfhidrasa citosólica descrita hasta la fecha es DES1. De esta manera DES1 y OASA1 llevan a cabo funciones opuestas para mantener la homeostasis de cisteína en el citosol. En el tercer capítulo de esta tesis se describe el papel de la cisteína en la respuesta inmune de las plantas. Partiendo de la base de que los transcriptomas de los mutantes deficientes en OAS-A1 y DES1 presentaban una alta correlación con la respuesta a distintos estreses bióticos, se estudió la respuesta de ambos mutantes a la infección por distintos patógenos de plantas. Los mutantes des1 son resistentes a patógenos necrótrofos y biotrófos y acumulan ácido salicílico, es decir, se comportan como mutantes SAR (resistencia sistémica adquirida). En cambio, los mutantes oas-a1 son más sensibles a ambos tipos de patógenos y carecen de respuesta hipersensible durante la resistencia inducida por efector (ETI: effector-triggered immunity). Estos resultados muestran que la cisteína podría ser un metabolito crucial durante la interacción planta-patógeno, ya que su desequilibrio en el citosol tiene claras consecuencias en la susceptibilidad de las plantas a patógenos. Puesto que la isoforma citosólica OAS-A1 es la principal enzima OASTL de Arabidopsis, un control eficiente de su actividad es crucial para mantener la homeostasis de cisteína en condiciones de estrés. Tanto el estrés abiótico como biótico conducen a la producción de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno, que conducen a la producción de peroxinitrito, un potente agente nitrante que tiene la capacidad de nitrar de forma no estocástica los residuos de tirosina de las proteínas. En el cuarto capítulo de esta tesis hemos demostrado que OAS-A1 sufre un proceso de inactivación producido por la modificación específica del residuo de tirosina 302 mediante nitración, inhibiendo la actividad enzimática de OAS-A1. Esta modificación posttraduccional de OAS-A1 mediante nitración puede representar un rápido y eficiente mecanismo regulatorio para controlar la biosíntesis de cisteína y glutatión en respuesta a distintos factores de estrés.

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