PCR-basierte molekulare Differenzierung von Mycobacterium bovis und Mycobacterium caprae mittels MIRU-VNTR-Typisierung

ألمانية. Der Erforschung von Ausbrüchen ver-schiedenster Krankheiten ist gerade in der heutigen Zeit des kontinental über-greifenden Tourismus und Tierhandels eine besondere Bedeutung zuzumessen. Bei der Übertragung von Krankheiten zwischen Tier und Mensch, den so genannten Zoonosen, gilt dies im besonderen Maße. Die Rindertuberkulose, hervorgerufen durch Mycobacterium (M.) bovis und M. caprae, ist eine Zoonose, die in vielen Teilen der Welt häufig, in Deutschland nur noch sporadisch auftritt. Im Rahmen dieser Diplomarbeit, durchgeführt am Veterinärmedizinischen Referenzlabor für Tuberkulose, wurden Bakterienstämme der Spezies M. bovis und M. caprae mit Hilfe einer Multilocus-Varianzanalyse charakterisiert. Basis dafür waren mykobakterienspezifische repetitive Einheiten, die in variabler Anzahl an bestimmten Stellen des Genoms lokalisiert sind (MIRUs, VNTRs). Es handelt sich dabei um ein PCR-basiertes Typisierungssystem, welches für Untersuchungen zur molekularen Epidemiologie der Tuberkulose besonders gut geeignet ist. Aus einem Panel von 27 in der veterinärmedizinischen und humanmedizinischen Literatur beschriebenen Gen-Loci sollten diejenigen definiert werden, welche für die in Deutschland vorkommenden mykobakteriellen Klone der Spezies M. bovis und M. caprae das größtmögliche diskriminatorische Potential aufweisen. Es wurden zunächst 12 dieser Sequenzen, die für veterinärmedizinische Isolate als besonders geeignet gelten, als Zielsequenzen verwendet. Im späteren Verlauf der Arbeit wurde deren Anzahl auf elf reduziert. Die PCR-Protokolle wurden zunächst mit einem M. bovis BCGStamm als Referenzstamm optimiert, um anschließend die Differenzierung von neun M. bovis-, und sechs M. caprae- Feldstämmen von möglichst unterschiedlicher Herkunft durchzuführen. Außerdem wurden zwei weitere Kontrollstämme verwendet. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe der Auswertesoftware E.A.S.Y Win32 bezüglich ihrer Molekulargewichte analysiert, wodurch die genaue Anzahl der repetitiven Elemente und somit das individuelle Muster der einzelnen Stämme errechnet werden konnte. Parallel dazu wurden im Nationalen Referenzzentrum für Mykobakterien in Borstel (SH) dieselben Referenz- und Feldstämme mit 24 MIRU-VNTR-Loci untersucht und mittels automatisierter Kapillarelektrophorese analysiert. Das diskriminatorische Potential für diese 11 bzw. 24 Loci wurde berechnet. Insgesamt konnten mit Hilfe von 11 Loci 11 MIRU-VNTR-Muster innerhalb der 15 Feldund zwei Kontrollstämme unterschieden werden, wohingegen mit 24 Loci 14 verschiedene Muster erkannt wurden. So zeigte sich, dass das kleinere „veterinärmedizinische“ Panel der VNTR-Loci auch bei veterinärmedizinischen Isolaten aus Deutschland ein etwa ebenso großes diskriminatorisches Potential aufweist wie das größere „humanmedizinische“ Panel.