PL: Analiza regulacji metabolizmu cukrów i glicerolu u drożdży Yarrowia lipolytica | EN: The analysis of sugar and glycerol metabolism in the yeast Yarrowia lipolytica

abstractPL: Drożdże Yarrowia lipolytica to mikroorganizmy o wysokim potencjale przemysłowym, szczególnie cenione za swoje predyspozycje do produkcji związków chemicznych, znajdujących zastosowanie w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym oraz paliwowo-energetycznym. Y. lipolytica zdolne są do wykorzystywania szerokiej gamy źródeł węgla do wzrostu i biosyntezy pożądanych produktów, takich jak substraty hydrofobowe (lipidy, węglowodory) oraz hydrofilowe (monosacharydy, glicerol), które mogą być również pozyskiwane z surowców odpadowych. Pomimo ogromnej ilości badań związanych z tymi drobnoustrojami, wiedza dotycząca funkcjonowania centralnego metabolizmu węgla u Y. lipolytica wciąż wymaga uzupełnienia, w szczególności w celu wdrażania wydajnych procesów biotechnologicznych na skalę przemysłową. W niniejszej rozprawie doktorskiej analizowano zjawisko preferencyjnego wykorzystania glicerolu względem glukozy przez Y. lipolytica, rozważano wpływ glicerolu i glukozy, a także dostępności azotu na globalną ekspresję genów, badano wpływ interakcji występujących pomiędzy transporterami heksoz (Yht) a heksokinazą na preferencyjne wykorzystanie glukozy względem fruktozy oraz charakteryzowano heksokinazę Y. lipolytica i określano wpływ jej unikalnej struktury przestrzennej na metabolizm i jego regulację. Dane pochodzące z sekwencjonowania transkryptomów komórek hodowanych w warunkach chemostatu wskazały, że ekspresja genów u Y. lipolytica jest w większym stopniu zależna od stężenia azotu niż rodzaju wykorzystywanego źródła węgla. W szczególności, ekspresja heksokinazy (YlHXK1) okazała się być wyjątkowo podatna na zmiany dostępności azotu w podłożach hodowlanych. Co więcej, wysoka ekspresja YlHXK1 w podłożach o niskiej zawartości tego pierwiastka wydaje się wpływać na ekspresję innych genów, w tym tych związanych z cyklem Krebsa i biosyntezą erytrytolu. Podobnie jak wiele innych mikroorganizmów, Y. lipolytica podczas wzrostu w podłożach zawierających mieszaninę glukozy i fruktozy, w pierwszej kolejności wykorzystują glukozę, jednak w przeciwieństwie do innych drożdży, utylizacja fruktozy rozpoczyna się dopiero po całkowitym wyczerpaniu glukozy, co znacząco wydłuża czas trwania bioprocesów. Poprzez nadekspresje transporterów heksoz oraz heksokinaz (natywnej oraz fruktofilnej z drożdży Schizosaccharomyces pombe) i analizie kinetyki wzrostu i wykorzystania substratów przez skonstruowane transformanty dowiedziono, że preferencyjne wykorzystanie glukozy względem fruktozy zależy przede wszystkim od powinowactwa natywnej heksokinazy do glukozy. Co ciekawe, połączenie nadekspresji którejkolwiek z badanych heksokinaz z transporterami heksoz doprowadziło do produkcji znaczących ilości polioli (31,5 g/L) z glukozy i fruktozy, co dotychczas możliwe było po zastosowaniu glicerolu jako źródła węgla. Dodatkowo, nadekspresja fruktofilnej heksokinazy oraz transporterów heksoz pozwoliła na skrócenie czasu trwania tego procesu, a także skutkowała 23% poprawą biosyntezy polioli z glukozy i fruktozy w porównaniu do procesów z glicerolem. Przeprowadzono również szczegółowe badania heksokinazy z drożdży Y. lipolytica (YlHxk1), enzymu o unikalnej strukturze, wyróżniającego się 37-aminokwasową sekwencją tworzącą niespotykaną w żadnej innej znanej heksokinazie pętlę. Poprzez integrację metod bioinformatycznych oraz eksperymentalnych wykazano, że pętla w YlHxk1 jest niezbędna do pełnienia funkcji katalitycznych przez to białko, a przez to do wzrostu Y. lipolytica w podłożach zawierających glukozę i/lub fruktozę. Wskazano także pozytywny wpływ dodatkowej pętli w heksokinazie na proces wiązania z trehalozo-6 fosforanem (T6P), inhibitorem glikolizy, czego dowodem jest 4,7-krotnie mniejsza wrażliwość heksokinazy z częściową delecją tego regionu na inhibitor. Co więcej, dowiedziono, że nadekspresja YlHXK1 powoduje zmianę preferencyjnego wykorzystania glicerolu względem glukozy podczas wzrostu w podłożach zawierających mieszaninę tych substratów.

abstractEN: The yeast Yarrowia lipolytica are microorganisms with high industrial potential, especially valued for their abilities to produce chemical compounds used in the food, pharmaceutical and energy industries. Y. lipolytica are able to use a plethora of carbon sources for growth and biosynthesis of desired products. These inlude hydrophobic (lipids, hydrocarbons) as well as hydrophilic (monosaccharides, glycerol) substrates, which can be also obtained from waste materials. Despite the vast amount of research dedicated to these microorganisms, the knowledge on the central carbon metabolism in Y. lipolytica still needs to be completed, in particular to implement efficient biotechnological processes on an industrial scale. In this dissertation, the phenomenon of preferential use of glycerol over glucose by Y. lipolytica was analyzed, the influence of glycerol and glucose as well as the availability of nitrogen on global gene expression was considered, the influence of interactions between hexose transporters (Yht) and hexokinase on the preferential use of glucose over fructose and Y. lipolytica hexokinase was characterized and the influence of its unique conformation on metabolism and its regulation was determined. The data from whole transcriptome sequencing of the cells grown under chemostat conditions indicated that gene expression in Y. lipolytica is more dependent on nitrogen concentration than on the type of carbon source used. In particular, expression of hexokinase (YlHXK1) has proved to be extremely susceptible to changes in nitrogen availability in the culture media. Moreover, high expression of YlHXK1 in media with low nitrogen concentrations appears to influence the expression of other genes, including those related to the Krebs cycle and erythritol biosynthesis. Like many other microorganisms, when grown in media containing a mixture of glucose and fructose, Y. lipolytica first use glucose, however, unlike other yeasts, fructose utilization begins only after complete glucose depletion, which significantly extends the duration of bioprocesses. Through overexpression of hexose transporters and hexokinases (native and fructophilic from the yeast Schizosaccharomyces pombe) and the analysis of growth kinetics and substrate utilization by the constructed transformants, it was proved that the preferential use of glucose over fructose depends primarily on the affinity of native hexokinase for glucose. Interestingly, the combination of overexpression of any of the tested hexokinases with hexose transporters led to the production of significant amounts of polyols (31.5 g/L) from glucose and fructose, which was previously possible with the use of glycerol as a carbon source. In addition, overexpression of fructophilic hexokinase and hexose transporters allowed to shorten the duration of this process, and resulted in a 23% improvement in the biosynthesis of polyols from glucose and fructose compared to the processes with glycerol. Detailed studies of the yeast Y. lipolytica hexokinase (YlHxk1), an enzyme with a unique structure distinguished by a 37-amino acid sequence, forming a loop not found in any other known hexokinase were also carried out. By integrating bioinformatic and experimental methods, it has been shown that the loop in YlHxk1 is necessary for this protein to perform its catalytic functions and thus for the growth of Y. lipolytica in glucose- and/or fructose-containing media. The positive effect of the loop in hexokinase on the binding process with trehalose-6-phosphate (T6P), an inhibitor of glycolysis, was also indicated, as evidenced by a 4.7-fold lower sensitivity to the inhibitor of the hexokinase with a partial deletion of this region. Moreover, overexpression of YlHXK1 has been shown to alter the preferential utilization of glycerol over glucose during growth in media containing a mixture of these substrates.

status: finished

collation: 69