PL: Wpływ modyfikacji płynności błony komórkowej plemników psa na ich wybrane właściwości w nasieniu poddanym kriokonserwacji | EN: The effect of modification of the membrane fluidity of canine sperm cells on their selected properties in cryopreserved semen

abstractPL: Kriokonserwacja jest podstawową metodą stabilizacji i przechowywania materiału biologicznego. Poddając tej procedurze plemniki, należy się liczyć z różnicami gatunkowymi i osobniczymi w zakresie ich podatności na proces mrożenia-rozmrażania. Na jakość nasienia po rozmrożeniu wpływa wiele czynników, między innymi skład zastosowanego rozrzedzalnika, tempo mrożenia i rozmrażania, forma konfekcjonowania nasienia, jakość nasienia przed zamrożeniem, stres oksydacyjny i skład błony komórkowej plemników. Stale poszukuje się substancji, które pomogą zoptymalizować ten proces. W niniejszej pracy skupiono się nie tylko na modyfikacji środowiska, w jakim w poddaje się konserwacji plemniki, ale także na zmianie cech biofizycznych komórek rozrodczych w taki sposób, aby poprawić wyniki ich kriokonserwacji. W tym zakresie tematyka rozprawy dotyczy próby modyfikacji płynności błony komórkowej plemników i jej wpływu na zmiany, do jakich dochodzi podczas procesu mrożenia i rozmrażania gamet oraz na finalną jakość komórek po rozmrożeniu. Założono, że modyfikacja płynności błony komórkowej plemników poprzez dodatek 2-hydroksypropylo-β-cyklodekstryny (2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin, HBCD) lub kompleksu cyklodekstryna-cholesterol (cholesterol loaded cyclodextrin, CLC) doprowadzi do poprawy jakości nasienia psa po rozmrożeniu. Celem badań była wieloparametrowa ocena wpływu modyfikacji płynności błony komórkowej plemników psa na ich wybrane parametry w nasieniu poddanym kriokonserwacji. Ocena obejmowała badanie właściwości biofizycznych błony. Przeanalizowano ponadto zmiany w zakresie parametrów opisujących ruch plemników oraz zmiany dotyczące struktury i funkcji wybranych organelli męskich gamet. Kolejnym etapem pracy było badanie zdolności zapładniającej plemników za pomocą testów czynnościowych oceniających interakcję plemnik-osłonka przejrzysta oocytu. Przedłożona praca doktorska została przygotowana w oparciu o doświadczenia opisane w dwóch publikacjach. Badania opisane w pierwszej publikacji przeprowadzono w celu znalezienia najbardziej korzystnego stężenia CLC, które wykazuje pozytywny wpływ na jakość nasienia psów po rozmrożeniu. Trzy różne stężenia CLC (0,5 mg; 1 mg; 2 mg w przeliczeniu na 120 mln plemników) i 2-hydroksypropyl- β-cyklodekstryny (HBCD) (1 mg w przeliczeniu na 120 mln plemników) zostały użyte jako dodatek do rozrzedzalnika wykorzystywanego do kriokonserwacji. Wyniki uzyskane po zamrożeniu i rozmrożeniu próbek nasienia zostały porównane z grupą kontrolną, gdzie stosowano standardowy rozrzedzalnik bez dodatków. Próbki oceniano za pomocą komputerowego analizatora nasienia (computer assissted sperm analysis, CASA) i cytometrii przepływowej. Badanie andrologiczne zostało uzupełnione o analizę biofizyczną przy zastosowaniu specjalistycznej aparatury pozwalającej ocenić płynność błon, której miarą jest anizotropia i uogólniona polaryzacja błony komórkowej plemników. Dodanie 0,5 mg CLC w przeliczeniu na 120 mln plemników do nasienia psa przed mrożeniem znacząco zwiększyło odsetek plemników o ruchu postępowym (progressive motility, PMOT) i plemników o ruchu szybkim (rapid spermatozoa, RAP). Grupa z dodatkiem 1 mg HBCD w przeliczeniu na 120 mln plemników charakteryzowała się mniej liczną populacją plemników o ruchu postępowym oraz populacją o szybkim ruchu w stosunku do kontroli. Dodanie 1 mg i 2 mg CLC, a także samej cyklodekstryny (1 mg HBCD) zwiększyło odsetek plemników martwych niewykazujących peroksydacji lipidów (LPO) i zmniejszyło odsetek żywych plemników bez LPO. Inne parametry plemników oceniane przy pomocy cytometrii przepływowej nie różniły się istotnie pomiędzy kontrolą, a próbkami z dodatkiem HBCD lub CLC. Odnotowano także ciekawe zmiany cech biofizycznych błon. Dodatek 0,5 mg, 2 mg CLC i 1mg HBCD spowodował wzrost anizotropii mierzonej w temperaturze 23ºC. W grupie z 0,5 mg CLC wykazano najsilniejszą dodatnią, statystycznie istotną korelację pomiędzy odsetkiem plemników z uszkodzoną chromatyną (DFI) a populacją plemników o ruchu wolnym (SLOW). W tej samej grupie dodatnią korelację odnotowano także między populacją plemników o wysokim potencjale mitochondrialnym (HMMP) a PMOT i RAP. Najsilniejsza ujemna, istotna statystycznie korelacja występowała między plemnikami z HMMP, a SLOW. Wykazano największe różnice dla PMOT i RAP między grupą z 0,5 mg CLC i 1 mg HBCD. Grupa z dodatkiem 0,5 mg CLC cechowała się liczniejszą populacją plemników z wysoką aktywnością mitochondriów (HMP), plemników wykazujących szybki ruch (RAP), wykazujących ruch postępowy (PMOT) oraz żywych w porównaniu do grupy gdzie stosowano 1 mg HBCD. Wszystkie wykonane analizy jednoznacznie wyłoniły 0,5 mg CLC jako najkorzystniejsze stężenie, które zastosowano w trakcie kriokonserwacji. W tej części badań w powyższej grupie odnotowano zdecydowaną poprawę parametrów kinematycznych plemników po rozmrożeniu. Druga część badań zawarta w kolejnej publikacji miała na celu zbadanie związku między parametrami ruchliwości plemników po modyfikacji płynności błony komórkowej, a zdolnością męskich gamet do zapłodnienia. Ponownie sprawdzono, czy parametry kinematyczne oceniane za pomocą komputerowego analizatora nasienia (CASA) wyłonią to samo stężenie CLC jako potencjalnie najlepszy dodatek zastosowany do kriokonserwacji nasienia psa. Różnica w tej analizie polegała na tym, że tym razem plemniki oceniano po odwirowaniu próbek w celu oczyszczenia ich z żółtka jaja kurzego, co było niezbędne do przeprowadzenia kolejnych analiz. Dodatkowym celem tej części badania było sprawdzenie, czy stosowanie cyklodekstryn związanych z cholesterolem (CLC; 0,5 mg, 1 mg, 2 mg w przeliczeniu na 120 mln plemników) i 2-hydroksypropylo-ß-cyklodekstryny (HBCD; 1 mg w przeliczeniu na 120 mln plemników) wpływa na stopień kapacytacji plemników, badany za pomocą oceny stopnia fosforylacji tyrozyny oraz oceny stopnia wypływu cholesterolu z komórki. Jako podsumowanie, wykonany został test czynnościowy interakcji plemników z osłonką przejrzystą oocytu (zona binding assay, ZBA). Test ten pozwolił ocenić zdolność zapładniającą plemników poddanych kriokonserwacji z wybranym, najlepszym stężeniem CLC bez wykonywania zabiegów sztucznej inseminacji samic doświadczalnych tj. zgodnie z zasadami 3R. W ten sposób wdrożono zarówno ograniczenie, zastąpienie, jak i udoskonalenie metody badawczej. Zastosowanie CLC w stężeniu 0,5 mg/120 mln plemników spowodowało zwiększenie odsetka plemników ruchliwych (MOT), o ruchu postępowym (PMOT) i poruszających się ruchem szybkim (RAP) w porównaniu z grupą kontrolną. Z kolei dodanie HBCD spowodowało zmniejszenie MOT i PMOT oraz RAP w porównaniu z kontrolą. Odsetek żywych plemników bez wypływu cholesterolu z wnętrza komórki w porównaniu do kontroli wzrósł, gdy zastosowano rozrzedzalnik z dodatkiem 0,5 mg CLC. Nie zaobserwowano zmian w stopniu kapacytacji plemników w badanych grupach. Zdolność łączenia się plemników z osłonką przejrzystą oocytu była istotnie statystycznie niższa w grupie z 0,5 mg CLC niż w grupie kontrolnej, lecz nadal wyniki uzyskane w obu grupach były zdecydowanie wyższe w porównaniu do rezultatów uzyskanych przez innych autorów. Niniejsza praca wykazała, że modyfikacja właściwości biofizycznych błony komórkowej plemników psów poprzez dodatek CLC wpływa na ich podatność na proces zamrażania. Jednak tylko małe stężenie CLC (0,5 mg/120 mln plemników) poprawia jakość nasienia po rozmrożeniu bez negatywnego wpływu na inne parametry. Przeprowadzone doświadczenia pozwoliły również zauważyć, że poprawa parametrów kinematycznych plemników nie zawsze idzie w parze z lepszą zdolnością wiązania plemników z osłonką przejrzystą oocytów. Nie oznacza to jednak, że dodatek nie może być zastosowany, ponieważ znaczny odsetek plemników w próbkach z dodatkiem 0,5 mg CLC/120 mln plemników zachowuje zdolność do łączenia się z ZP oocytu i mogą być one wykorzystane do inseminacji.

abstractEN: Cryopreservation is the primary method of stabilizing and storing biological material. When subjecting sperm to this procedure, one should take into account their varying susceptibility to the freeze-thaw process. Many factors affect the quality of semen after thawing, including the composition of the diluent used, the rate of freezing and thawing, the form of semen packaging, the quality of semen before freezing, oxidative stress, and the composition of the sperm cell membrane. There is a constant search for substances that will help optimize this process. The focus of this dissertation is not only on modifying the sperm preservation environment, but also on altering the biophysical characteristics of germ cells in such a way as to improve their cryopreservation results. In this field, the subject of the dissertation is an attempt to modify the fluidity of the sperm cell membrane and its impact on the changes that occur during the process of freezing and thawing gametes and on the final quality of the cells after thawing. It was hypothesized that modification of sperm cell membrane fluidity by the addition of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HBCD) or cyclodextrin-cholesterol complex (CLC) would lead to improved canine semen quality after thawing. The aim of the study was a multiparameter evaluation of the effect of modifying the fluidity of the cell membrane of canine spermatozoa on their selected parameters in cryopreserved semen. The evaluation included an analysis of the biophysical properties of the membrane. In addition, changes in parameters describing sperm motility and changes regarding the structure and function of selected organelles of male gametes were analyzed. The next step of the experiment was to test the fertilizing ability of the sperm using functional tests that evaluate the sperm-zona pellucida (ZP) interaction. The submitted dissertation was prepared based on the experiments described in two publications. The research described in the first publication was conducted to find the most beneficial concentration of CLC that shows a positive effect on canine semen quality after thawing. Three different concentration of CLC (0.5 mg; 1 mg; 2 mg per 120 million spermatozoa) and 2-hydroxylpropyl-β -cyclodextrin (HBCD) (1mg per 120 million spermatozoa) were used as addition to the diluent used for cryopreservation. The results obtained after freezing and thawing the semen samples were compared with the control group, where a standard diluent without additives was used. Samples were assessed using computer-assisted semen analyzer (CASA), flow cytometry. The andrological examination was supplemented by biophysical analysis using specialized equipment that allows assessment of membrane fluidity, a measure of which is anisotropy and generalized polarisation of the sperm cell membrane. This part of the study confirmed that that increasing cholesterol in plasma membrane of canine spermatozoa can improve their freezability. Addition of 0.5 mg CLC calculated per 120 million spermatozoa to the semen before freezing significantly increased the percentage of progressive motile (PMOT) and spermatozoa with rapid movement (RAP). The group with addition of 1mg HBCD calculated per 120 million spermatozoa was characterized by a smaller population of sperm with progressive movement and a population with rapid movement compared to control. Addition of 1 mg and 2 mg of CLC and also the group with only cyclodextrin increased the percentage of dead sperm without lipid peroxidation (LPO) and decreased the percentage of live sperm without LPO. The same effect was observed when 1 mg HBCD was used. The population of viable spermatozoa without LPO was decreased in comparison to the control. Using of the addition of 1 mg of HBCD exhibited increasing dead spermatozoa with LPO compared to the control. Other sperm parameters assessed by flow cytometry were not significantly different between the control and HBCD- or CLC-supplemented groups. Interesting changes in the biophysical characteristics of the membranes were also noted. Anisotropy (ANISO) and generalized polarization (GP) of sperm membrane were measured at the room temperature (23 ºC) and body temperature (38 ºC). The addition of 0.5 mg and 2 mg of CLC and 1 mg of HBCD caused an increase in ANISO compared with the control group in RT. There were an interesting results of the correlation analysis between the examined structural and functional parameters of semen in the group with addition of 0.5 mg CLC and in the control group. The group with 0.5 mg CLC showed the strongest positive, statistically significant correlation between the percentage of spermatozoa with damaged chromatin (DFI) and the population of spermatozoa with slow motility (SLOW). In the same group, a positive correlation was also observed between the population of sperm with high mitochondrial potential (HMMP) and PMOT and RAP. The strongest negative, statistically significant correlation was between sperm from HMMP and SLOW. It was shown he greatest differences for PMOT and RAP between the group with 0.5 mg CLC and 1 mg HBCD. It was proved that the group with addition of 0.5 mg of CLC had a larger population of spermatozoa with high mitochondrial activity (HMMP), spermatozoa with rapid movement (RAP), spermatozoa with progressive movement (PMOT) and live spermatozoa compared to the group with 1 mg HBCD. All the analyses performed clearly identified the group with 0.5 mg CLC as the most beneficial concentration that was used in cryopreservation. In this part of the study, the above group showed a definite improvement in sperm kinematic parameters after thawing. The second part of the research included in the next publication was aimed to investigate the relationship between the sperm motility parameters after cell membrane fluidity modification and ability of male gametes to fertilize. Again, it was verified that kinematic parameters assessed with a computer-assisted semen analyzer (CASA) would emerge the same concentration of CLC as potentially the best addition applied in cryopreservation of dog semen. The difference in this analysis was that this time the sperm was evaluated after the samples were centrifuged to clear them of yolk, which was necessary for subsequent analyses. An additional aim of our study was to investigate whether the use of cholesterol-loaded cyclodextrins (CLC; 0.5 mg, 1 mg, 2 mg) and 2-Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin (HBCD; 1 mg) affects the capacitation of spermatozoa examined by assessing the level of tyrosin phosphorylation and by assessing the level of cholesterol efflux from the cell. As a summary, a functional test of the interaction of spermatozoa with the zona pellucida (Zona Binding Assay, ZBA) was performed. This test made it possible to assess the fertilizing ability of sperm cryopreserved with the selected best concentration of CLC without performing artificial insemination of experimental females, i.e. according to the 3R principles. In this way, both reduction, replacement and refinement of the test method were implemented. The application of CLC at a concentration of 0.5 mg/120 million spermatozoa resulted in an increase in the percentage of motile (MOT), with progressive motility (PMOT) and with rapid movement (RAP) spermatozoa compared to the control group. In turn, the addition of HBCD resulted in a decrease MOT and PMOT, as well as RAP, compared to the control. The percentage of viable spermatozoa without cholesterol efflux from within the cell compared to controls increased when the diluent with addition of 0.5 mg CLC was used. There was no change in the level of sperm capacitation in the study groups. The ability of sperm to bond with the oocyte's zona pellucida was significantly lower in the group with 0.5 mg of CLC than in the control group, but still the results obtained in both groups were significantly higher compared to the results obtained by other authors. The present study showed that modification of the biophysical properties of the cell membrane of canine spermatozoa by the addition of CLC, affects their susceptibility to the freezing process. However, only small concentration of CLC improve sperm quality after thawing without negatively affecting other parameters. The experiments also noted that improvements in sperm kinematic parameters do not always go hand in hand with improved sperm binding ability to the zona pellucida. However, this does not mean that the additive cannot be used, since a significant percentage of sperm in the samples with the addition of a 0.5mg CLC per 120 million spermatozoa retains the ability to bind to the ZP of the oocyte and can be used for insemination.

status: finished

collation: 93