Introgressão de híbridos transgênicos e convencional em milho crioulo: efeitos sobre fungos e bactérias endofíticas

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015.

O milho é a cultura mais amplamente distribuída em todo o mundo e possui um papel chave na segurança alimentar. Muitas pesquisas estão direcionadas ao milho transgênico, pois é amplamente cultivado e ainda gera dúvidas entre os cientistas. Os impactos ambientais das plantas transgênicas têm sido avaliados sobre os organismos não alvo da tecnologia, sobretudo os microrganismos endofíticos, uma vez que estão envolvidos em mecanismos de defesa e adaptação utilizados pelas plantas. Assim, nesse estudo buscou-se avaliar o efeito da inserção de transgenes e do fluxo gênico de transgenes sobre a estrutura de comunidades de microrganismos endofíticos uma variedade crioula de milho. Para isso, foram estudados três híbridos isogênicos, dos quais um deles era não geneticamente modificado (NGM), o segundo continha a transgenia Herculex, evento TC1507 (Hx) e o terceiro, a transgenia Herculex combinada com Roundup Ready, evento NK603 (Hxrr). A variedade crioula de milho utilizada foi a ?Rosado? (RS) conservada on farm por agricultores familiares do Extremo Oeste de Santa Catarina, Brasil. Através de polinizações manuais controladas foram inseridos os pólens dos híbridos em plantas de milho crioulo, durante duas gerações, a fim de simular a ocorrência de fluxo gênico reincidente, e assim gerar as populações de milho crioulo contendo 25, 50 e 75% da composição genética de cada híbrido, separadamente. Inicialmente avaliou-se bactérias e fungos endofíticos das folhas de plantas de milho, comparando apenas os quatro genótipos iniciais (RS, NGM, Hx e Hxrr), em quatro estádios do desenvolvimento das plantas, dois vegetativos (V3 e V4) e dois reprodutivos (R1 e R2). Para isso, em um ensaio a campo foram coletadas as folhas de três plantas de cada genótipo, em cada estádio, totalizando 48 amostras. Dessas amostras foram extraídos DNAs e feitas PCRs para amplificação do rDNA 16S de bactérias e da ssu rDNA de fungos, os quais foram avaliados por DGGE. Após as análises de cluster e ANOSIM, concluiu-se que as bactérias endofíticas variam apenas de acordo com o estádio fenológico, enquanto que os fungos endofíticos sofreram alterações devido ao genótipo das plantas. Com relação a estrutura da comunidade de fungos, RS diferiu dos demais genótipos avaliados, nos quatro estádios. Nos estádios vegetativos (V3 e V4), os fungos foram diferentes entre os híbridos com e sem transgenia. No estádio reprodutivo (R1) ainda foi possível diferenciar a comunidade de fungos entre os dois transgenes, porém o NGM foi semelhante ao Hx. Após isso, implantou-se o experimento a campo, com três repetições em blocos casualizados, a fim de comparar os quatro genótipos (RS, NGM, Hx e Hxrr) e mais nove populações de milho crioulo geradas, contendo 25, 50 ou 75% do genoma de cada híbrido. Coletou-se 10 plantas de cada tratamento, no estádio reprodutivo (R1) previamente selecionado, totalizando 390 amostras, das quais foi extraído DNA e amplificada a região ssu rDNA de fungos endofíticos para análise por DGGE. Após análises de cluster e ANOSIM, concluiu-se que os fungos endofíticos da variedade RS diferiram dos demais tratamentos, assim como observado no ensaio anterior. As populações com introgressão do transgene Hxrr foram as que mais sofreram alterações. Os efeitos não intencionais dos transgenes nas plantas ainda são desconhecidos, por outro lado o presente trabalho permite inferir que os transgenes afetam a diversidade estrutural de fungos endofíticos do milho e que os efeitos diretos sobre as plantas ainda devem ser estudados.<br>

Abstract : Maize is the most widely crop distributed around the world and it has a key role in food safety. Many researches are performed with transgenic maize because it is widely cultivated and still generates doubts among scientists. The environmental impacts of the transgenic plants have been evaluated on non-target organisms of the biotechnology, especially the endophytic microorganisms, since they are involved in defense mechanisms and adaptation used by plants. Thus, this study aimed at assessing the effect of the insertion of transgenes into the plant and gene flow on the structure of endophytic microbial communities of a corn landrace. Thus, we used three isogenic hybrids, of which one was the isogenic form not genetically modified form (NGM), the second contained the transgenic Herculex, TC1507 event (Hx), and the third, the transgenic Herculex combined with Roundup Ready, NK603 event (Hxrr). The corn landrace was "Rosado" (RS) conserved on farm by small-scale farmers in Western Santa Catarina, Brazil. The pollen of hybrids were used to pollinate RS for two generations through controlled pollinations in order to simulate the occurrence of recurrent gene flow and generate populations contain 25, 50 and 75% of the genetic background of each hybrid. Initially, endophytic fungi and bacteria from leaves of plants were evaluated, based on the four genitors genotypes (RS, NGM, Hx and Hxrr) in four stages of plant development, two vegetative (V3 and V4) and two reproductive (R1 and R2). Thus, in a field trial was collected leaves from three plants for each genotype and each stage, totaling 48 samples. DNAs were extracted from these samples, following of PCR amplifications with 16S rDNA of bacteria and ssu rDNA of fungi, which were evaluated by DGGE. After cluster analysis and ANOSIM, it may be concluded that endophytic bacteria vary according to the phenological stage, while the endophytic fungi change due to the genotype of plants. Regarding the structure of fungal community, RS differed from the other genotypes in the four stages. In the vegetative stages (V3 and V4), the fungi were different among the hybrids with and without genetic modification. In the reproductive stage (R1), the fungal community was different for the two transgenic hybrids (Hx and Hxrr), but NGM was similar to Hx. After that, the field experiment was implanted with three replications in a randomized block design, in order to compare the four genotypes (RS, NGM, Hx and Hxrr) and nine populations containing 25, 50 or 75% of the genome each hybrid separately. Leaves of 10 plants of each treatment were collected in the reproductive stage (R1) previously selected, totaling 390 samples. DNAs were extracted from these samples and the rDNA ssu region of endophytic fungi was amplified the rDNA ssu region for analysis through DGGE. After cluster analysis and ANOSIM, it may be concluded that endophytic fungi of RS differed from other treatments, such as previous test. Populations with introgression of Hxrr transgene suffered more changes. The unintended effects of transgenes in plants is still unknown; on the order hand, we can infer from this work that the transgenes affect the structural diversity of endophytic fungi of corn and the direct effects on plants still need to be studied.