Análises bioquímicas e fisiológicas do milho transgênico tolerante ao Roundup Ready (evento Nk603) submetido ao déficit hídrico e aplicação de herbicida

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015.

Uma importante questão ainda muito polêmica no mundo está relacionada com os riscos da liberação comercial de organismos geneticamente modificados (OGM), particularmente o impacto ambiental que as plantas geneticamente modificadas podem gerar. Este trabalho tem como objetivo geral investigar as possíveis alterações bioquímicas e dos produtos da expressão gênica de uma variedade comercial de milho transgênico tolerante ao Roundup Ready® (evento NK603), submetida a condições de déficit hídrico e aplicação de herbicida. O primeiro ensaio realizado, denominado Ensaio sem herbicida, foi um ensaio em blocos ao acaso com distribuição trifatorial (Transgenia x Estresse x Ambiente). Este ensaio foi realizado em casa de vegetação (cv) e câmara de crescimento (cc) (fator Ambiente), composto por híbridos transgênicos (T) e sua isolinha convencional (C) (fator Transgenia), submetidos a rega controle (CONT) ou seca (SECA) (fator Estresse). O segundo ensaio, denominado Ensaio com herbicida, foi um ensaio em blocos ao acaso unifatorial, o qual foi formado também por três blocos, sendo cada unidade experimental composta por um grupo de três vasos (uma planta por vaso), com dois tratamentos: Milho Transgênico submetido a seca com aplicação de herbicida (TSECA RR); Milho Transgênico submetido a seca sem aplicação de herbicida (TSECA). A análise proteômica comparativa DIGE demonstrou diferença na expressão de proteínas entre as plantas de milho transgênicas (NK603) e sua isolinha convencional mais próxima (31 spots). O fato de terem sido detectadas proteínas diferencialmente expressas entre os tratamentos CCONT x TCONT (17 spots) e CSECA x TSECA (14 spots), leva a conclusão de que estas plantas não diferem entre si apenas pela expressão da proteína alvo da transformação genética (CP4 EPSPS) conforme proposto pela empresa proponente desta tecnologia e assim levado em consideração pelas agências regulatórias. Além disso, apesar do nível de variação causada pelo modificação genética não se diferir do nível da variação causada pelo ambiente (em termos de número total de proteínas diferenciais), as plantas transgênicas respondem diferencialmente com relação a sua linha isogênica quando cultivadas no mesmo ambiente, o que apoia a ideia da existência de efeitos pleiotrópicos oriundo da inserção da sequência exógena para o evento NK603. A análise comparativa do proteoma no segundo ensaio ainda revelou que a aplicação de herbicida nas plantas transgênicas em situação de estresse por desidratação resulta no aumento da expressão de algumas proteínas e até no provável silenciamento de um ou mais genes responsável pela transcrição de uma proteína. As análises de quantificação de alguns dos principais fitormônios envolvidos nos mecanismos de defesa a estresse pelas plantas, revelou que a concentração de ABA, MeJA, SA, CA e GA3 foi diferente entre as plantas transformadas e não-transformadas, bem como as interações foram significativas entre os fatores  Estresse e  Ambiente . Verificou-se também que a situação de estresse e o cultivo em diferentes ambientes resultaram na variação no conteúdo de todos os fitormônios analisados. Com relação a análise quantitativa de lignina, a transformação genética também provocou alterações no teor de LTGA, pois assim como encontrado por outros autores em diferentes eventos de transformação, as plantas transformadas (NK603) apresentaram teores de lignina superior aos das plantas não transformadas.Além disso, a análise de lignina nos tratamentos do segundo ensaio revelou que a aplicação de herbicida em plantas transgênicas em situação de déficit hídrico provocou ainda mais o aumento no teor de lignina. O tratamento TSECA RR apresentou em média um aumento de 33% na concentração de LTGA em comparação ao tratamento TSECA. Portanto, os resultados encontrados neste trabalho concordam com resultados de outros estudos sobre a existência de efeitos pleiotrópicos relacionados a expressão proteica, aumento nos teores de fitormônios e lignina em plantas geneticamente modificadas (evento NK603), submetidas a diferentes condições de cultivo.<br>

Abstract : A worldwide important issue still very controversial is related to the risks of commercial release of genetically modified organisms (GMO), particularly the environmental impact that genetically modified (GM) plants can generate. This study aims to investigate possible biochemical changes of a commercial hybrid of GM maize (event NK603) and its counterpart, subjected to drought stress conditions and herbicide application. The first experiment, called experiment without herbicide, was a factorial experiment being the plots arranged in a three randomized block design (Transgenic x Stress x Environment). This experiment was conducted in a greenhouse (cv) and growth chamber (cc) (Environment factor), composed of transgenic hybrid (T) and its conventional isogenic line (C) (Transgenic factor), subject to water control (CONT) or drought stress conditions (SECA) (Stress factor). The second experiment, called Experiment with herbicide application, was an experiment in a randomized block design, with three repetitions. In that case each experimental unit was composed of a group of three pots (one plant per pot) with two treatments: GM maize submitted to drought stress and herbicide application (TSECA RR); GM maize subjected to drought stress without herbicide application (TSECA). The comparative proteomic DIGE showed difference in protein expression between transgenic maize (NK603) and its conventional isoline (31 spots). The fact that differentially expressed proteins detected between CCONT x TCONT treatments (17 spots) and CSECA x TSECA (14 spots), leads to the conclusion that these plants do not differ only by the expression of the target gene transformation (CP4 EPSPS) as proposed by the proponent of the technology. Furthermore, although the level of variation caused by genetic modification does not differ from the level of variation caused by the environment (in terms of total number of differential proteins), transgenic plants respond differentially in respect to their isogenic line when grown in the same environment, which supports the idea of pleiotropic effects from the genetic transformation for the NK603 event. The comparative analysis of the proteome in the second experiment also showed that herbicide application in transgenic plants under drought stress results in increased expression of some proteins and in a probable silencing of one or more genes responsible for the transcription of a protein. Quantification analyzes of some of the major plant hormones involved in defense mechanisms to stress in plants, showed that the concentration of ABA, MeJA, SA, CA and GA3 were different between the GM plants and non-GM, as well as interactions between "Stress" and "Environment" were significants. It was also verified that the stress situation and cultivation in different environments resulted in variation in the content of all plant hormones analyzed. Regarding the quantitative analysis of lignin, the genetic transformation also changed lignin content. Similarly to other studies done in different events of genetic transformation, the GM NK603 plants presented higher lignin content than the non-GM plants. In addition, the lignin analysis in the second experiment revealed that the herbicide application in transgenic plants under drought stress situation causes increase in lignin content. The TSECA RR treatment showed 33% increase in the concentration of LTGA compared to TSECA treatment. Therefore, the findings of this study agree with the results found by other studies about the presence of pleiotropic effects related to protein expression, plant hormones synthesis and lignin content in plants of the event NK603, under different growing conditions.