Isolamento, seleção, identificação e aplicação de leveduras não-convencionais com potencial para a produção de aromas em fermentado de maçã

Orientador: Prof. Dr. Gilvan Wosiacki

Coorientador: Prof. Dr. Alessandro Nogueira

Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Processos Biotecnológicos. Defesa: Curitiba, 06/12/2011

Bibliografia: fls. 193-196

Área de concentração: Agroindústria e biocombustíveis

Resumo: O fermentado de maçã consiste em um dos principais sub-produtos da agroindústria da maçã. Entretanto, no Brasil este produto além de recente, apresenta baixa qualidade aromática. A microbiota natural das maçãs apresenta uma população de leveduras variando de 10 - 105 ufc.cm-2 ou g, entre espécies Saccharomyces sp. e não-Saccharomyces. As leveduras não convencionais são reconhecidas na literatura como produtoras de compostos voláteis frutados capazes de melhorar o perfil sensorial de bebidas fermentadas. O presente trabalho teve como objetivo isolar cepas de leveduras não-Saccharomyces a partir do mosto de maçãs, selecionar, conservar e identificar as eminentes produtoras de aromas frutados para avaliá-las na elaboração do fermentado de maçã, em culturas puras, mistas e sequenciais, com relação à cinética de crescimento, atributos físico-químicos e perfil aromático dos fermentados obtidos. O isolamento foi realizado em meio seletivo a partir do mosto bruto de maçãs das cultivares Gala e Fuji. Foram selecionadas cepas não-convencionais por meio de teste sensorial de produção de aromas frutados ou florais. Na identificação das leveduras foram consideradas preliminarmente suas características morfológicas, fisiológicas e posteriormente por metodologia molecular foi realizado o sequenciamento das regiões D1/D2 da subunidade maior do rRNA. Testes de preservação dos isolados ocorreram por liofilização e a -80ºC, com armazenamento por 12 meses, à temperatura ambiente e em ultra-freezer, respectivamente. Para as fermentações foi utilizado mosto de maçã da cv. Gala e monitorado o crescimento das leveduras, parâmetros físico-químicos, cinéticos e perfil aromático ao longo de 10 dias de fermentação. As técnicas de headspace estático e microextração em fase sólida (SPME) foram utilizadas para a captura dos compostos voláteis dos fermentados, analisados em CG. Os resultados da identificação revelaram a presença de dez espécies, sendo Candida oleophila, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora guilliermondii, Hanseniaspora uvarum, Lodderomyces elongisporus, Pichia anomala, Pichia fermentans e Rhodotorula mucilaginosa, das quais, cinco foram pela primeira vez relatadas em mostos de maçãs. Na fermentação pura foi confirmado que as cepas do gênero Hanseniaspora contribuem positivamente com o perfil aromático de fermentados de maçã. Em fermentação mista e sequencial, os resultados evidenciaram uma boa interação entre as leveduras fermentativas e oxidativas. A análise cromatográfica dos compostos voláteis permitiu identificar etanoato de etila, butanoato de etila acetato de isopentila, etanoato de hexila, 2-hidróxi propanoato de etila, octanoato de etila, decanoato de etila, 1,4-butanoato de etila, dodecanoato de etila, etanal, ácido butanóico e octanóico, etanol, 3-metil-1-butanol, 2-hexanol, 1-hexanol, 2-fenil etanol e 2-heptanona, nos fermentados elaborados por fermentação mista e sequencial. Foi verificado que tanto a liofilização quanto a conservação a -80ºC garantiram a viabilidade das leveduras durante o tempo estudado. Desta forma, considerando a presença do grupo dos ésteres e, principalmente, dos álcoois superiores, responsáveis por aromas frutais e florais, os ensaios de culturas mistas e sequenciais revelaram a possibilidade de contribuir para a qualidade aromática do fermentado de maçã.

Abstract: The fermented apple is one of the main by-products of the apple industry. However, in Brazil, this product is recent and has low aromatic quality. The natural apples microbiota has a yeast population oscillating between 10 - 105 ufc.cm-2 or g, between species Saccharomyces sp. and non-Saccharomyces. The non-conventional yeasts are recognized in the literature as fruity volatiles compounds producers able of improve with the sensory profile of fermented beverages. This work aims to isolate non-Saccharomyces yeast strains from the apple must, select, preserve and identify the main fruity flavors producers to evaluate them in the preparation of apple wine, in pure, mixed and sequential cultures, with respect to growth kinetics, physical-chemical attributes and aromatic profile of the fermented obtained. The isolation occurred in the selective medium from the raw apple must of Gala and Fuji cultivars. Non-conventional strains were selected by sensory testing for the fruity or floral aroma production. In the yeasts identification, were preliminarily considered their morphological and physiological characteristics and, then, by molecular methodology it was made the sequencing of D1/D2 regions of the large subunit of rRNA. Conservation tests of the isolates occurred by freeze drying and frozen at -80ºC, with storage for 12 months at room temperature and ultra-freezer, respectively. For the fermentations were used apple must of Gala cultivar and it was monitored the yeast growing, physical-chemical parameters, kinetics and the aroma profile along 10 days of fermentation. The static headspace and solid phase microextraction (SPME) technique were used for the volatile compounds capture of the fermented, and it was analyzed by gas chromatography. The identification results revealed the presence of ten species, being Candida oleophila, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Clavispora lusitaniae, Hanseniaspora guilliermondii, Hanseniaspora uvarum, Lodderomyces elongisporus, Pichia anômala, Pichia fermentans and Rhodotorula mucilaginosa, of which, five were reported for the first time in apples musts. In the pure fermentation it was confirmed that the strains of the genus Hanseniaspora contribute positively to the aromatic profile of apple wine. In the mixed and sequential fermentation the results showed a good interaction between the fermentative and oxidative yeasts. The chromatographic analysis of volatile compounds identified ethanoate, ethyl butanoate, ethyl acetate isopenthyl, hexylethanoate, 2-hydroxy ethyl propanoate, ethyl octanoate, ethyl decanoate, ethyl 1,4-butanoate, ethyl dodecanoate, butanoic and octanoic acid, ethanol, 3-methyl-1-butanol, 2-hexanol, 1-hexanol, 2-phenyl ethanol and 2-heptanone in the fermented made by mixed and sequential fermentation. It was notice that both freeze drying and conservation at -80ºC ensured the yeasts viability during the period studied. Thus, considering the presence of the esters group and, especially, the superior alcohols, responsible by fruity and floral aromas, the mixed and sequential cultures testing revealed the possibility to contribute to the aromatic quality of apple wine.