Methodological developments and application in translational biology of gene editing techniques in bread wheat | Développements méthodologiques et applications en biologie translationnelle de techniques d'édition du génome chez le blé tendre

إنجليزي. A major challenge for agriculture will be its capacity to feed the world in the 21st century in the face of climate change and population growth, while meeting the need for agro-ecological transition. Bread wheat (Triticum aestivum) will be a key issue, and biotechnologies a key tool to be mobilised. Three lines of research involving the CRISPR-Cas tool were addressed in this PhD. First, we evaluated the use of alternative enzymes to Cas9, in particular for their ability to perform multiple mutations simultaneously. We tested the Cas12a enzyme, recognising a different PAM from Cas9 and generating a cohesive cleavage site, as well as the CAS9-NG enzyme, recognising a shorter PAM than Cas9. We obtained very interesting results since we were able to induce up to 16 mutations simultaneously in the same plant, which is particularly encouraging for the future use of this tool in varietal selection programmes. Secondly, we sought to carry out targeted insertion of stop codon cassettes in order to induce more precise gene silencing than is currently possible. Preliminary results obtained by transient expression and analysed by nested PCR have shown that numerous targeted insertion events can be demonstrated, that undesirable degradation events occur preferentially at the ends of the cassette compared to the ends of the genomic DNA generated by the CRISPR-Cas cut, as well as an asymmetry in the occurrence of stochastic DNA insertion events at the ends of the cassette. However, we did not succeed in regenerating a plant with a stable insertion, which implies that a joint improvement of transformation and integration efficiencies will have to be achieved to reach this goal. The results obtained have been the subject of a patent application by the industrial partner, and a publication has been written for submission after the eventual acceptance of the patent. The third axis of our thesis had an applicative vocation of the tools developed in the first two axes on the theme of disease resistance. Indeed, as the agro-ecological transition induces a drastic reduction of synthetic pesticides, a special effort must be made to improve genetic control of diseases, which implies major research efforts to understand plant-pathogen interactions. In this context, in collaboration with the MDC laboratory of the GDEC, we focused on 20 candidate genes for Fusarium head blight (FHB) susceptibility in wheat. The results obtained show that it is possible to extinguish three genes simultaneously, which was previously impossible using conventional mutagenesis techniques. The resulting plant will be phenotyped for its pathogen resistance profile. Taken together, the results of the thesis show that the CRISPR systems are capable of reaching a large number of loci simultaneously in common wheat, and that a targeted insertion of a small DNA fragment is possible but with a very low frequency in stable transformation in the current state of the technology. These results could be applied for the first time to solve the problem of phenotyping QTLs associated with weak effects. They show the need to master and develop these new technologies to answer research questions. These results are also a step towards using editing techniques to support varietal selection, for example by deleting previously identified susceptibility genes in elite varieties. Implications for breeding programmes and possible developments in the light of EU regulatory guidelines are discussed.

فرنسي. Un défi majeur pour l'agriculture sera sa capacité à nourrir le monde du 21ème siècle face au changement climatique et à l'accroissement de la population, tout en répondant à la nécessité de la transition agroécologique. Le blé tendre (Triticum aestivum) en sera un enjeu clé, et les biotechnologies un outil clé à mobiliser. Trois axes de recherche mettant en jeu l'outil CRISPR-Cas ont été abordés dans cette thèse. Tout d'abord nous avons évalué l'utilisation d'enzymes alternatives à Cas9, en particulier pour leur capacité à réaliser des mutations multiples. Nous avons testé l'enzyme Cas12a, reconnaissant un PAM différent de Cas9 et générant un site de coupure cohésif, ainsi que l'enzyme CAS9-NG, reconnaissant un PAM plus réduit que Cas9. Nous avons obtenu des résultats très intéressants puisque nous avons réussi à induire jusqu'à 16 mutations simultanément dans la même plante, ce qui est particulièrement encourageant quant à l'utilisation future de cet outil dans des programmes de sélection variétale. Dans un second axe, nous avons cherché à réaliser l'insertion ciblée de cassettes porteuses de codons stop afin de provoquer des extinctions de gènes plus précises que celles réalisées actuellement. Les résultats préliminaires obtenus par expression transitoire et analysés par PCR emboitée ont montré que de nombreux évènements d'insertion ciblée peuvent être mis en évidence, que les évènements indésirables de dégradation se déroulent préférentiellement aux extrémités de la cassette par rapport aux extrémités de l'ADN génomique générées par la coupure CRISPR-Cas, ainsi qu'une asymétrie dans l'occurrence des évènements stochastiques d'insertion d'ADN aux extrémités de la cassette. Nous n'avons par contre pas réussi à régénérer de plante présentant une insertion stable, ce qui implique qu'une amélioration conjointe des efficacités de transformation et d'intégration devra être réalisée pour atteindre cet objectif. Les résultats obtenus on fait l'objet d'une demande de dépôt de brevet par le partenaire industriel, et une publication a été rédigée pour une soumission postérieure à l'éventuelle acceptation du brevet. Le troisième axe de notre thèse avait une vocation applicative des outils développés dans les deux premiers axes sur la thématique de résistance aux maladies. En effet, la transition agroécologique induisant une réduction drastique des pesticides de synthèse, un effort tout particulier doit être réalisé pour mettre en place un contrôle génétique des maladies, ce qui sous-entend des efforts importants de recherche pour comprendre les interactions plantes-pathogènes. Dans ce contexte, nous nous sommes intéressés, en collaboration avec le laboratoire MDC du GDEC, à 20 gènes candidats de sensibilité du blé à la fusariose de l'épi. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'éteindre trois gènes simultanément, ce qui était jusqu'à présent impossible par les techniques de mutagénèse classique. La plante résultante sera phénotypée pour son profil de résistance au pathogène. Pris dans leur ensemble, les résultats de la thèse montrent que le système CRISPR est capable d'atteindre un grand nombre de locus simultanément chez le blé tendre, et qu'une insertion ciblée d'un petit fragment d'ADN est possible mais avec une fréquence très faible à l'état stable dans l'état actuel des technologies. Ces résultats ont pu trouver ne première application pour résoudre le problème du phénotypage des QTL à effets faibles. Ils montrent la nécessité de maitriser et de développer ces nouvelles technologies pour répondre à des questions de recherche. Ces résultats sont également une avancée vers l'utilisation des techniques d'édition pour appuyer la sélection variétale, par exemple en supprimant des gènes de sensibilité préalablement identifiés dans des variétés élite. Les implications dans les programmes de sélection ainsi que les éventualités de développement en fonction des orientations règlementaires de l'Union Européenne sont discutées.