dPCR som alternativ til qPCR i fiskehelseanalyser - analytisk presisjon for prøver med lavt innhold av genetisk materiale

Formålet med dette prosjektet var å vurdere den analytiske presisjonen til digital PCR (dPCR) for prøvemateriale med lavt innhold av genetisk materiale fra fisk og vannprøver. Hovedmålet var å undersøke om dPCR kan være et alternativ til kvantitativ PCR (qPCR) for prøver med lavt innhold av genetisk materiale. Bakgrunnen for prosjektet er behovet for presise og sensitive metoder i diagnostisering av sykdomsagens i oppdrettsnæringen, spesielt der tradisjonell qPCR nærmer seg sin deteksjonsgrense. Nøyaktig diagnostikk muliggjør tidlig forebygging og bedre kontrollstrategi, noe som er essensielt for både dyrevelferd og økonomisk bærekraft. dPCR ble benyttet for å analysere prøver med lavt innhold genetisk materiale, og resultatene ble satt opp i forhold til eksisterende qPCR-resultater. Prosjektet undersøker påvisning av parasitten N. perurans (analysert fra gjellesvaber), viruset IPNV (analysert fra melkeprøver) og bakterien Y. ruckeri (analysert fra vannprøver) ved bruk av dPCR-teknologi. Det ble analysert fortynningsrekker og tester med varierende templatvolum, og resultatene ble vurdert ut fra repeterbarhet, sensitivitet og metodespesifikke faktorer som separasjon og andel «rain». Resultatene viste høy linearitet i 10-folds fortynningsrekkene (≥ R2= 0,9984), som indikerer at dPCR har god kvantifiseringsevne også ved lave konsentrasjoner. Samtidig ble det observert økt variasjon i resultater for prøver nær deteksjonsgrensen for qPCR. For IPNV og Y. ruckeri var separasjonen mellom positive og negative partisjoner tydelig, med lav andel rain. For N. perurans ble to nivåer med fluorescenssignal og økt rain observert, noe som indikerer behov for optimalisering. dPCR fremstår som en sensitiv metode med høy presisjon, men resultatene viser også behov for metodeoptimalisering for de ulike assayene. Evaluering av metodene kom frem til at en kombinasjon av dem kan være hensiktsmessig. qPCR egner seg godt for rutinemessig screening, mens dPCR kan brukes til å bekrefte funn med lav mengde DNA/RNA eller ved spesielle behov for kvantifisering. Det er i tillegg viktig å skille mellom de ulike patogentypene, da klinisk betydning og krav til følsomhet varierer.

The aim of this project was to assess the analytical performance of digital PCR (dPCR) for sample material with low concentrations of genetic material from fish and water samples. The main objective was to investigate whether dPCR could serve as an alternative to qPCR for samples with low levels of genetic material. The background for this project lies in the need for precise and sensitive methods for detecting pathogens in the aquaculture industry, particularly in cases where traditional qPCR approaches its limit of detection. Accurate diagnostics enables early prevention and improved control strategies, which are essential for both animal welfare and economic sustainability. dPCR was used to analyze samples with low concentrations of genetic material, and the results were compared with existing qPCR results. The project examined the detection of the parasite N. perurans (analyzed from gill swabs), the virus IPNV (analyzed from milt samples), and the bacterium Y. ruckeri (analyzed from water samples) using dPCR technology. Dilution series and tests with varying template volumes were analyzed, and the results were evaluated based on repeatability, sensitivity, and method-specific factors such as separation and the proportion of “rain”. The results showed high linearity in the 10-fold dilution series (≥ R2= 0,9984), indicating that dPCR has strong quantification capabilities even at low concentrations. At the same time, increased variation was observed in results from samples near the qPCR detection limit. For IPNV and Y. ruckeri, the separation between positive and negative partitions was clear, with a low proportion of rain. For N. perurans, two levels of fluorescence signal and increased rain were observed, indicating a need for further assay optimization. dPCR appears to be a sensitive method with high precision, but the results also highlight the need for optimization tailored to the individual assays. The evaluation concluded that a combination of the methods may be beneficial. qPCR is well-suited for routine screening, while dPCR can be used to confirm findings with low amounts of DNA/RNA or in cases where precise quantification is needed. It is also important to differentiate between pathogen types, as their clinical relevance and sensitivity requirements vary.